KOD-Plus- 실시예 4inverse PCR에 의한 부위 특이적 변이 도입

KOD -Plus- 실시예 4 inverse PCR에 의한 부위 특이적 변이 도입

인버스 PCR은 상동 부분이 없는 역방향의 2종류의 프라이머를 사용한다 플라스미드 전주를 PCR로 증폭하는 방법으로, 프라이머의 디자인에 의해, 염기의 치환이나 삽입, 결실을 도입할 수 있습니다. 이번에는 pUC19의 lacZα펩티드의 5'말단에 His-Tag와 BglⅡsite를 도입했습니다. (아래 그림)

(부위 특이적 변이 도입 방법에 대해서는 라이프사이언스 실험 시리즈 vol.8에서도 소개하고 있습니다. 여기)

【방법】
(1) 돌연변이 도입
이하의 조건으로 PCR을 실시했습니다.


 프라이머 배열 :
 
      ※프라이머는, T4 보다 5'인산화를 실시했습니다.

PCR 반응액 30μL Ligation high [ Code No. LGK-101 ]을 15μL 첨가하고, 16℃, 2hr 인큐베이션하여 PCR 산물의 셀프라이게이션 반응을 실시했습니다.

라이게이션 반응액을 에탄올 침전시키고, 17μl의 멸균수로 재용해시켰다. 주형 플라스미드 절단으로 인해 DpnⅠ 20units [Code No. DPN-101] 10× ;Buffer 2μL과 함께 첨가하고, 37℃에서 1hr 반응시켰다.

반응액으로 Competent high JM109 < /span> [ Code No. DNA-900 ] 을 형질전환했습니다.

(2) 돌연변이 확인
형질 전환 된 E.coli JM109를 밤새 배양 한 한천 플레이트상의 콜로니에 대한 KOD Dash [ Code No. LDP-101], M13 프라이머에 의한 콜로니 다이렉트 PCR을 실시했습니다.
 
PCR 산물에 제한효소 BglⅡ를 작용시켜 절단의 유무에 의해 변이 삽입의 유무를 확인했습니다.
 
돌연변이 삽입을 확인한 콜로니에 대해 시퀀스를 확인했습니다.

【결과 및 고찰】
KOD -Plus- Mutagenesis Kit [Code No. SMK-101]을 판매하고 있습니다. 이 Kit는 3단계의 간단한 프로토콜로, PCR 산물의 셀프라이게이션과 인산화를 동시에 실시하므로, 인산화한 프라이머를 준비할 필요가 없습니다. Competent high DH5α와의 세트로 되어 있는 KOD -Plus- Mutagenesis DH5α Set [ Code No. SMK101/DNA903 ]도 있습니다.

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