T4 DNA Ligase를 주체로 한 고효율의 1액형의 라이게이션 시약입니다. 다양한 말단을 가진 DNA의 연결 반응에 널리 사용할 수 있습니다.
동결/융해에 대한 안정성과 반응효율 향상을 위해 조성조건을 최적으로 하고 있습니다. 라이게이션에 필요한 rATP, DTT 등을 포함한 1액 타입의 라이게이션 시약입니다. DNA 시료 용액의 절반량~동량의 Ligation high를 첨가하는 것만으로 T4 DNA Ligase 단체로 사용한 경우보다 양호한 결과를 얻을 수 있습니다.

●간편

DNA 샘플 용액에 Ligation high를 혼합하는 것만으로 고효율의 라이게이션을 실시할 수 있습니다.

● 고효율

T4 DNA Ligase를 단독으로 사용한 경우에 비해 50배 이상의 효율을 얻을 수 있습니다.

● 우수한 안정성

50회의 동결/융해를 실시해도 라이게이션 효율의 저하는 인정되지 않습니다.

1. 동결 융해에 대한 안정성

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동결 융해 후, 권장 프로토콜을 따라 라이 게이션 반응을 실시했다. 그 결과, 50회의 동결 융해 후에도 안정한 것을 알 수 있었다.

2. 소금 농도의 영향

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DNA 용액에 포함되는 염(NaCl)의 농도가 라이게이션 효율에 미치는 영향을 검토했습니다. 평가는 pBluescript ^® Ⅱ를 SacⅠ로 절단한 단편(5ng)을 NaCl 농도가 다른 TE Buffer 5μL에 용해하고, DNA 용액 중에 포함되는 염 성분이 셀프라이게이션의 효율에 얼마나 영향을 미치는지를 지표로 했다. 방법으로서는, DNA 단편 용액에 등량 또는 반량의 Ligation high에 더해, 16℃에서 30min.반응시킨 후, 2μL를 형질전환에 이용하여, 생긴 콜로니수를 계측했습니다. 그 결과, NaCl 농도가 높을수록 라이게이션 효율이 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 제한효소인 H Buffer 등 염농도가 높은 DNA 용액을 라이게이션에 사용하는 경우에는 한번 TE Buffer 등으로 치환하는 것이 좋습니다.

3. PCR 산물의 TA 클로닝에 있어서의 반응 시간의 영향

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이 키트를 사용하여 PCR 산물을 T 벡터에 삽입하고 시간의 영향을 조사했습니다. 실험법으로서는, 우선, λDNA의 500bp를 타겟으로 rTaq DNA Polymerase로 PCR을 행하고, 그 반응액 1μL(약 6.4ng)와 2μL의 T 벡터(50ng)를 3μl의 Ligation high에 첨가하고, 16℃에서 각 반응 시간 인큐베이션하고, 라이게이션 반응을 실시하였다. 그 후, 반응액 2μL로 대장균을 형질전환하여, 플레이트 상에 생긴 백색 콜로니 및 청색 콜로니의 수를 측정하였다. 그 결과, 반응 시간이 길수록 효율이 증가하고, 16시간에 최고가 되는 것을 알 수 있었다. 또, 청콜로니의 수는 2시간 이상에서는 변화가 없었지만 반응시간이 길수록 백색 콜로니의 수가 증가하고 있다. 따라서, Ligation high를 이용한 PCR 산물의 TA 클로닝에 있어서, 높은 삽입율을 얻고 싶은 경우에는 2시간 이상, 바람직하게는 16시간 이상 반응시키는 것을 추천합니다.

※단시간에의 TA클로닝을 희망하시는 경우는 Ligation high Ver.2를 추천합니다.

4. 반응 시간 검토

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λ/ Hin dⅢ를 인서트로서, Ligation high를 이용하여 16℃에서 각 반응 시간 라이게이션을 실시하고, 에탄올 침전 후, 전기영동을 실시했습니다. 그 결과, Hin dIII 절단 말단에 있어서는, 약 5분이라도 충분히 라이게이션 반응이 완료하고 있는 것이 밝혀졌습니다.

1) RL Hawkins et al., Current Microbiol. , 38 : 335-341(1999)

제품 사용 문헌
1)H. Kamiya et al., Nucleic Acids Research , 28(7) : 1640-1646. (2000)
2)H. Kamiya et al., Biol.Pharm.Bull ., 27(5) : 621-623(2004)
3) Tatsuya Suzuki et al., AnalyticalSciences , 23(1) : 65-70 (2007)