아래 프로토콜의 DNA 말단의 평활화에는 "KOD DNA Polymerase" [Code No. KOD-101] , 라이게이션에는 "Ligation high" [Code No. LGK-101] 를 사용합니다.
「KOD DNA Polymerase」[Code No. KOD-101] 이외의 KOD계 DNA polymerase를 이용한 평활화 프로토콜은 이쪽.

(1) 평활화 반응액을 다음과 같이 조제합니다.
반응액을 조제하기 전에 각 시약을 충분히 교반한 후 사용해 주십시오. 냉동 시약은 완전히 녹여야합니다.

* "KOD DNA Polymerase" [Code No. KOD-101] 의 파트입니다.

모든 액을 첨가한 후, 반응액을 볼텍스 등으로 충분히 교반한 후 서멀 사이클러에 세트 하십시오.

(2) 72℃, 2min. 인큐베이션.

(3) 얼음에서 냉각합니다.

(4) 반응액을 그대로 라이게이션 반응에 사용할 수 있습니다.

(라이 게이션 반응의 예)

16 ° C, 1 시간 incubated.

※평활화 처리를 잘 실시하기 위해서

① 에탄올 침전 등으로 TE 버퍼로 치환한 DNA의 사용을 표준적인 조작으로 하고 있습니다만, 다음의 방법으로도 가능합니다.
<제한 효소 처리한 DNA의 경우>
H, M, L, TA 완충액을 이용한 반응액이면, 반응액을 그대로 DNA 용액으로서 이용하여 위의 반응 조성으로 평활화 처리할 수 있습니다.

<Taq계 DNA polymerase를 이용하여 PCR을 실시한 산물의 경우>
PCR 후의 반응액을 일부 취하고, KOD를 첨가하고, 72℃, 2min.처리합니다.
이때 KOD는 Taq DNA polymerase와 동일한 단위 수를 더합니다.
10× Buffer #1, 25mM MgCl 2 , 2mM dNTPs의 첨가는 필요하지 않습니다.
dNTPs는 반응시 농도에서 0.2mM이 최적이므로 부족한 경우 추가합니다.

② DNA 말단 10pmol을 처리할 수 있습니다. 선형 pUC18 DNA2.7kb이면 약 10μg에 해당합니다.

③ 반응액을 조제할 때 KOD를 마지막에 첨가해 주십시오. dNTPs가 공존하지 않는 환경하에서는 KOD의 3'→5'exonuclease가 강하게 작용하여 과도하게 DNA를 깎을 수 있습니다.

④ 72℃, 2min.에서 충분한 평활화 반응이 이루어집니다. 또, 표준의 반응 조건이면, 30min.까지 시간을 연장해도 효율은 변하지 않습니다.