HOMERNA-direct 실시예 41-step Realtime PCR에 의한 단백질 키나아제 발현 정량
RNA-direct 실시예 4 1-step Realtime PCR에 의한 단백질 키나아제 발현 정량
실시간 PCR을 이용하여 목적 유전자의 발현량을 측정하는 방법 에는 먼저 RNA를 cDNA로 변환하고 그것을 주형으로 실시간 PCR을 실시하는 「2-step 반응계」와 RNA를 주형으로 하여 역전사 반응과 실시간 PCR을 연속적으로 실시하는 「1-step 반응계」 그리고 있습니다. 1단계 실시간 PCR은 시약 분배 작업이 한 번만 이루어져 높은 처리량에 적합합니다. 또한 샘플 간 교차 오염의 위험을 줄입니다. RNA-direct ® Realtime PCR Master Mix는 Thermus thermophilus HB8 균주에서 유래된 Tth DNA Polymerase가 2가 망간 이온(Mn2+) 존재 하에서 강한 역전사 활성을 나타내는 것을 이용한, 1 효소계에 의한 1-step 실시간 PCR용 2x 마스터 믹스입니다. 내열성 DNA 폴리머라제를 이용한 역전사 반응은, 일반적인 역전사효소와 비교하여, 반응을 고온에서 실시할 수 있기 때문에, 입체 구조를 취하기 쉬운 주형 RNA로부터의 증폭이나, 역전사 반응의 특이성을 높인다 에 적합합니다.
본 실험에서는 RNA-direct ® SYBR™ Green Realtime PCR Master Mix를 이용한 novel Protein Kinase C(nPKC)의 서브타입 각 인간 각종 조직별 발현 프로파일 해석을 실시했습니다. 또한 2 단계 반응 시스템과의 결과를 비교했습니다.
<실험 방법>
【샘플】
10종류의 인간 유래 Total RNA(뇌, 심장, 신장, 비장, 간, 소장, 근육, 폐, 위, 대장)을 주형으로 사용했습니다. 각 반응계(20μL)에 대해 각각 50ng의 total RNA를 첨가하여 해석을 실시했습니다. 또 이들과는 별도로, 검량선 작성용으로서 상기 10종의 total RNA 중 4종(심장, 비장, 근육, 폐)을 픽업하여 혼합한 것에 대해서, 200ng 및 그 5배 희석 계열을 작성하고, 각각 동시에 반응을 실시했습니다.
【프라이머】
PKCδ, PKCε, PKCη, PKCθ 사슬 길이를 가진 프라이머를 디자인했습니다. 또한 샘플 사이의 mRNA 양을 보정하기 위해 β-Actin을 내부 표준으로 사용했습니다. 프라이머 농도는 각 0.2μM으로 설정했습니다. 각 프라이머의 배열은 아래에 표시됩니다.
【반응 기기·조건】
Applied Biosystems® 7900HT를 사용하여, 오른쪽 조건에서 증폭 검출을 실시했습니다.
<결과 및 고찰>
1. β-Actin 및 PKC 표준 곡선 생성
상대 정량에 사용 검량선용의 표준으로서, nPKC의 발현이 높을 것으로 예상된 4개의 장기 유래의 total RNA를 혼합한 것을 희석하여 사용하였다(200×5-nng(n=0,1,2…) ). 첫째, 각각 Ct 값에서 β-Actin 및 각 PKC 샘플의 검량선을 작성했습니다. 또한 동시에 각 조직의 샘플을 반응 당 5 
0ng 및 200ng을 사용하여 유사하게 증폭시켰다.
그 결과, 주형량과 Ct값과의 상관성이 매우 양호한 것이 나타났다. β-Actin 검량선을 오른쪽에 표시합니다. 또한, 융해 곡선 해석의 결과, 프라이머 다이머 등의 생성은 확인되지 않았습니다. 상대 정량의 경우, 플라스미드 등에 클로닝한 유전자로부터 전사 반응을 이용하여 합성한 RNA를 정량의 표준으로 하는 방법도 있습니다만, 이번과 같이 단순히 생체로부터 추출한 RNA를 희석하여 사용하는 것만으로도 문제 없게 검량선을 만들 수 있었습니다.
2. PKC 각 하위유형의 조직별 발현량 계산
β-Actin 및 PKC 각 하위유형의 검량선을 사용하여 각 유전자의 조직별 존재량을 계산합니다. 했다. 다음으로, β-Actin의 mRNA의 상대량으로 보정하고, 각 조직에 있어서의 각 PKC의 상대 발현량을 산출했습니다.
그 결과, PKCε, PKCθ에 있어서, 조직별 발현량 분포가 크게 편향되어 있는 것이 밝혀졌습니다. 이 결과는 이미 보고된 정보 1)2)와 잘 일치하는 것으로 확인되었습니다. 또한 이번에 50ng와 200ng의 total RNA를 이용하여 PCR 반응을 실시하여 각각 상대값을 산출했지만, 어느 농도의 RNA에서도 거의 같은 결과를 나타냈다.
3. 2단계 반응계와의 결과 비교
1단계 반응계와 2단계 반응계(역전사 반응 및 실시간 PCR 그리고 별도로 수행) 결과에 무결성이 있는지 확인하기 위해, 우리의 고효율 역전사 키트 ReverTra Ace -α-® [코드 번호 FSK-101] 및 실시간 PCR 키트 SYBR™ Green Realtime PCR Master Mix -Plus- [ Code No. QPK-211 ]을 사용하여 핵산 증폭 실시간 모니터링 장치 : LineGene (BioFlux 사)에 의한 2-step 실시간 PCR을 실시한 경우와의 결과를 비교했습니다 (PKC & delta; 만 실시).
그 결과, 오른쪽에서 볼 수 있듯이, 양자의 결과는 거의 일치하고, 1-step 반응계에 의한 결과는 2-step 반응계와 동등한 신뢰성이 있고, 2- step 반응계에서 1-step 반응계로의 전환도 쉽다는 것이 밝혀졌다.
참고 문헌 1) Akita Y. et al., J Biol Chem. 265:354-362(1990)< br /> 2) Osada S. et al., Mol Cell Biol. 12:3930-3938 (1992)
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