HOMEKOD -Plus- 실시예 7 Colony direct-PCR에 의한 각종 미생물 유전자의 간편·신속 검출
KOD -Plus- 실시예 7 Colony direct-PCR에 의한 각종 미생물 유전자의 간편·신속 검출
[데이터 제공]
국립 감염 증 연구소 생물 활성 물질 부, 일본 미생물 클리닉 주식회사 기술부 도자키 나오시 님
국립 감염증 연구소 생물 활성 물질부 호리타 국원 님
【방법】
그람 양성균으로서 임상 유래의 장구균(Enterococcus faecalis)과 방선균(Streptomyces속의 2균종 및 미동정 희소방선균주), 그람 음성균으로서 임상 유래의 Legionella pneumophila 2주와 Serratia marcescens 1주, 및 곰팡이 (효모)로 Candida albicans 1 균주를 사용했습니다 (Table 1). 각각 표준 배지에서 자란 콜로니에서 보이지 않는 양의 균체를 멸균 발톱 분지의 선단에 부착시켜 (실시예 6 참조), 그것을 직접 PCR 반응액에 접촉하고 그대로 PCR을 실시했습니다. PCR 반응액 조성과 PCR 조건은 프로토콜에 준했습니다. Table 1에 나타낸 바와 같이, 장구균, 방선균, Legionella는 복수의 유전자를 표적으로 하여, 상응하는 복수의 프라이머를 혼합하여 사용하였다. 어닐링 온도는 각 프라이머에 적합한 온도를 설정했습니다. 또한 방선균에 대해서는 DNA의 GC 함량이 높은(약 70%) 것을 고려하여 변성 온도를 98℃로 설정했습니다.
【결과 및 고찰】
그림 1, 2, 3에 나타낸 바와 같이, 어느 시험균주에서도 표적 유전자가 CD-PCR에 의해 문제없이 선택적 에 증폭했습니다.
어쨌든 S. aureus의 경우 1) 과 마찬가지로, 보이지 않을 정도로 소량의 균체를 반응 액에 첨가함으로써 양호하다. 증폭이 얻어졌지만, 보이는 정도의 균체를 첨가한 경우에는 Candida(Fig.3)를 제외하고 증폭 반응의 저해가 보였다.
Multiplex CD-PCR을 실시한 케이스(장구균, 방선균, Legionella)에서는, 알려진 유전자 프로파일과 일치하는 유전자 증폭 패턴을 얻을 수 있고, 
사용한 PCR 조건의 선택성이 높은 것을 확인할 수 있었습니다. 장구균의 표적 유전자는 S. aureus에도 공통으로 존재하는 것으로 알려져 있으며, 이것을 반영하는 PCR 증폭이 인정되었다.
방선균의 경우는, 시험균 중에서 유일하게 균사상으로 생육해, 한천중의 균사로부터 공중으로 균사를 늘린다(그 앞에 포자를 붙인다)라고 하는 특징을 물론, 한천 중의 균사에 이쑤시개를 만지는 것이 키포인트라고 판단되었습니다.
Legionella와 Serratia에 대해서는 그람 음성인 점에서 E.coli와 동일하지만 E.coli에서는 문제가 없는 눈에 보이는 양을 PCR 반응액에 첨가하면 좋은 결과를 얻을 수 있다. 수 없습니다.
Candida를 대상으로 하는 PCR에서는, 일반적으로 효소 처리나 열수 추출에 의해 얻어지는 DNA가 주형으로서 이용되지만, 여기에 소개한 바와 같이 CD-PCR에서도 충분히 표적 유전자의 증폭이 가능합니다. 게다가, 보일 정도의 양의 균체를 사용해도 문제 없기 때문에, E.coli와 같이 CD-PCR을 용이하게 적용할 수 있다고 판단할 수 있습니다. 덧붙여 데이터는 나타내지 않지만, 마찬가지로 효모인 Saccharomyces cerevisiae에서도 CD-PCR이 가능했습니다.
일반적으로 콜로니를 이용한 PCR(colony PCR)은 대장균을 제외하고 콜로니 균체를 열수 처리하고, 누출된 DNA를 포함하는 상청을 주형으로 사용하는 방법을 가리킨다. 경우가 많습니다. CD-PCR은 이 DNA 추출 조작을 생략하고 있으므로 CD-PCR(특히 multiplex CD-PCR)을 적용할 수 있다면 다수의 균주를 저비용으로 단시간에 검사할 수 있다는 이점이 있습니다.
CD-PCR에 대한 일반적인 우려는 결과의 재현성이지만, 우리의 경험은 전통적인 방법과 아무런 변화가 없는 재현성이 좋은 결과를 얻고 있습니다. 키포인트 중 하나는 균체의 첨가량(실시예 6(nig.
"미량의 균체"또는 "보이지 않는 양의 균체"를 발톱에 접촉시키기 위해서는 "정말 균체가 부착되어 있습니까?" '라는 감각적으로 불안을 기억하는 정도의 접촉 방법으로 충분합니다 (몇 번의 연습으로 습득 가능). 또 다른 핵심은 KOD -Plus-와 같은 고성능 DNA polymerase를 사용하는 것입니다. 이 두 가지가 갖추어지면 누구나 각종 균종에 있어서 CD-PCR을 만족할 수 있는 레벨로 적용할 수 있다고 생각됩니다. 꼭 자신의 눈으로 확인해 주셨으면 한다.
참고 문헌 1) 도자키 나오시, 호리타 고쿠모토:Upload No.69: p. , 이시카와 아츠시, 호리타 고쿠모토 : Jpn. J. Antibiot ,53, 422-429(2000)
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