진단시약원료 효소

< img src="/inday_fileinfo/img/v520240422194449.">

준비 및 사양

< table class="darkGray"> 외관 연청색 무정형 분말, 동결건조< /tr> 활동 GradeⅢ 200U/mg-solid 이상 오염물질 카탈라제 ? 1.0×10-1%포스파타제? 2.0×10-2% 안정 장치 BSA, 붕산염

속성

< tr>< td>(표 1)
안정성 안정적입니까? 20℃ 최소 1년 동안(그림 1)
분자량 140,000
등전점 5.5±0.2
미카엘리스 상수 2.7×10-4M(아스코르베이트)
억제제 시안화물, Na2S, 디에틸디티오카바메이트(Na)
최적 pH pH 5.5? 6.5(그림 2)
최적 온도 약. 45℃(그림 3)
pH 안정성 6.0? 10.0(25℃, 20시간)(그림 4)
열 안정성 45℃ 미만 (pH 7.0, 30분)(그림 5)
기질 특이성< /th>이 효소는 아스코르빈산과 여러 아스코르빈산 유도체를 산화시킵니다.
다양한 화학물질의 효과

응용

이 효소는 아스코르브산의 효소적 측정과 임상 분석에서 아스코르빈산의 간섭을 제거하는 데 유용합니다.

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분석

원칙

Principle

아스코르빈산의 소멸은 분광광도법으로 245nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 1단위는 분당 1마이크로몰의 아스코르브산을 감소시킵니다.

방법

시약

A. 아스코르빈산 용액1.0mM ［원액(10mM)을 1.0mM이 포함된 0.2M KH2PO4 용액으로 10배 부피로 희석합니다. EDTA.]( 신선하게 준비)
원액 : L-아스코르브산 176mg(MW=176.13)/1.0mM EDTA를 함유한 1.0mM HCl 용액 100ml(0~5°C에서 보관하면 1개월 동안 안정함)< /td>
B. Na2HPO4 용액10mM
C. HCl 용액0.2N
D. 효소 희석제10mM Na2HPO4 용액(0.05% BSA 함유)(새로 준비해야 함)

절차

1.다음 반응 혼합물을 시험관에 준비하고 30℃ 약 5분간 담가주세요.

0.5ml기질 용액(A)
0.5mlNa2HPO4 용액 (B)
(반응 혼합물의 pH는 5.6이어야 합니다.)
분석 혼합물의 농도
KH2PO482mM
Na2HPO45.5mM
아스코르브산0.45mM
EDTA0.45mM
BSA45.4μg/ml

2.효소 용액* 0.1ml를 넣고 섞습니다.

3.정확히 5분 후 30℃, HCl 용액(C) 3.0ml를 첨가하여 반응을 정지시키고 물에 대한 245nm에서 흡광도를 측정한다(OD 테스트).
동시에 반응 혼합물을 먼저 혼합하여 바탕액을 준비한다. 30℃에서 5분 동안 배양한 후 HCl 용액(C) 3.0ml를 첨가한 후 효소 용액(OD 공백)을 첨가합니다.

* 효소제를 얼음처럼 차가운 증류수(60U/ml 이상)에 녹여 0.15로 희석? 얼음처럼 차가운 효소 희석제(D)가 포함된 0.25U/ml, 분석 직전.

계산

활동량은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다:

  • 활동량(U/ml) =

  • ΔOD(OD 공백? OD 테스트)×Vt×df

    10.0×1.0×t×Vs

= ΔOD×0.820×df

체중 활동량(U/mg) = (U/ml)×1/C

Vt : 총 용량(4.1ml)
Vs: 샘플 용량(0.1ml)
10.0: pH 1.0의 분석 조건에서 아스코르빈산의 밀리몰 흡광 계수(cm2/마이크로몰)
1.0: 광선 길이(cm)
t: 반응 시간(5분)
df: 희석 인자
C: 효소 농도 용해 상태(c mg/ml)

참고자료< /h2>

1)T.Nakamura, N.Makino 및 Y.Ogura; J.Biochem., 64,189(1968).

2)V.Ts.Aikazyan 및 RMNalbandyan; FEBS LETTERS, 104,127(1979).

3)GAWhite 및 FGSmith; Nature, 190,187 (1961).

표 1. 다양한 화학물질이 아스코르베이트 산화효소에 미치는 영향

［10mM에 용해된 효소 K-인산염 완충액, pH 7.0 contg. 0.2% BSA (55 U/ml) was incubated with each chemical at 25℃ for 1hr.]

  • < th align="left">-< td>< /tr>
    ChemicalConcn.(mM) Residual activity(%)
    None100
    Metal salt2.0
    MgCl296
    CaCl298
    Ba(OAc)2 98
    FeCl3< /td>100
    CoCl255
    MnCl2100
    ZnCl2100
    CdCl286
    NiCl299
    CuSO480
    Pb (OAc) 2100
    AgNO3< /td>15
    HgCl25.2
    2-Mercaptoethanol2.094
    PCMB 1.086
    • < li>
    < td>Tween 20< td>SDS
    ChemicalConcn.(mM)Residual activity(%)
    MIA2.0100
    NEM2.0 98
    IAA2.097
    Hydroxylamine2.099
    EDTA5.0100
    o-Phenanthroline2.084
    α,α ′-Dipyridyl1.098
    Borate5099
    NaF2.098
    NaN3 2.095
    Triton X-1000.10%100
    Brij 350.10%100
    0.10%100
    Span 200.10% 100
    Na-cholate0.10%97
    0.05%100
    DAC0.05%99
Ac, CH3 CO; PCMB, p-Chloromercuribenzoate; MIA, Monoiodoacetate;
EDTA, Ethylenediaminetetraacetate; IAA, lodoacetamide; NEM, N-Ethylmaleimide;
SDS, Sodium dodecyl sulfate; DAC, Dimethlbenzylalkylam ="pointList">

  • Fig.1. Stability (Powder form)

    < p class="ttl">Fig.1. Stability (Powder form)

    (kept under dry conditions)

  • Fig.2. pH-Activity

    Fig.2. pH-Activity< /p>

    30℃ in 0.1 M buffer solution: pH4.0-6.0,acetate; pH6.0-8.0, phosphate pH8.0-9.0,borate

  • Fig.3. Temperature activity

    Fig.3. Temperature activity

    (in 0.33M phosphate buffer,pH5.6)

  • Fig.4. pH-Stability

    Fig.4. pH-Stability

    25℃,20hr-treatment with 0.1M buffer solution;pH4.0-6.0, acetate;pH6.0-8.0,phosphate;pH8.0-10.0,borate

    • < li>

    Fig.5. Thermal stability

    Fig.5. Thermal stability

    30min-treatment with 10mM phosphate buffer,pH 7.0(contg.0.2% BSA) enzyme concn.: 15U/ml

    활성 측정법(Japanese)

    1. 원리

    원리

    Ascorbic acid의 손실량 245nm의 흡광도 변화로 측정한다.

    2. 정의

    하기 조건 하에서 1분에 1마이크로몰의 아스코르브산을 산화하는 효소량을 1단위(U )로 한다.

    3. 시약

    • 1.0mM 아스코르브산 용액 [보존 용액(10mM의 L-아스코르브산 용액)을 1.0 mM EDTA를 포함하는 0.2M KH2PO4 용액으로 10배 희석한다.(용시 조제) 보존 용액은 176mg의 L-아스코르브산 특급, MW=176.13)을 정칭하고 1.0mM EDTA를 포함하는 1.0mM HCl 용액 100ml에 용해하여 조제한다(0~5℃ 보존으로 1개월은 사용 가능).
    • 10mM Na2HPO4용액
    • 0.2N HCl 용액

    효소 용액: 효소 표제를 미리 빙냉한 증류수로 용해(60U/ml 이상)하고, 분석 직전에 0.05% BSA를 포함하는 10mM Na2HPO4 용액(빙냉)으로 0.15~0.25U/ml로 희석한다.

    4. 절차

    1. 시험관에 다음 반응 혼합물을 준비하고 30 ℃에서 약 5 분 동안 예비 가온한다.

    0.5ml기질 용액(A)
    0.5mlNa2HPO4 용액 < /td>(B)
    (반응 혼합물의 pH는 5.6)

    2. 효소 용액 0.1ml를 첨가하여 반응을 개시한다.

    3.30℃에서 정확하게 5분간 반응시킨 후, HCl 용액(C) 3.0ml를 첨가하여 반응을 정지시킨다 . 이 액체 당 245 nm에서의 흡광도를 측정한다 (ODtest).

    4.맹검은 반응혼액 1을 30℃으로 5분간 방치한 후, HCl 용액(C) 3.0ml를 첨가하여 혼화 그런 다음 효소 용액 0.1ml를 첨가하여 준비한다. 이하와 같이 흡광도를 측정한다 (ODblank).

    5. 수식

    • U/ ml =

    • ΔOD(OD blank?OD test)×4.1(ml)×희석 배율

      10.0×1.0×5(분)×0.1(ml)

    < td>= ΔOD×0.82× 희석 배율
    U/mg= U/ml×1/C
    10.0: 아스코르브산의 상기 측정 조건하(pH1.0)에서의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm2/micromole)
    1.0: 광로 길이(cm)
    C : 용해시 효소 농도 (c mg/ml)

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