진단시약원료 효소

N-ACETYLNEURAMINIC ACID ALDOLASE

준비 및 사양

< tr>< th align="left">안정제
외관황색 무정형 분말, 동결건조
활성GradeⅢ 15U/mg-고체 이상(30U/mg-단백질 이상)
(약 30% 함유) 안정제)
오염물질카탈라제≤1.0%
NADH 산화효소≤1.0×10-3%
만니톨, EDTA

속성

< td>65℃ 미만 (pH 7.5, 30분) (그림 6)
안정성 20℃에서 안정적 최소 1년 동안 (그림 1)
분자량 대략. 98,000
등전점 4.6±0.1
미카엘리스 상수 2.5×10-3M(N-아세틸뉴라민산)
구조 효소 분자당 3개의 하위 단위(약 35,000)
억제제 p-클로로머쿠리벤조에이트, SDS, Hg++, Ag+
최적 pH < /th>7.58.0 (그림 3)
최적 온도 70℃ (그림 4)
pH 안정성 pH 6.09.0 ( 10℃, 25시간) (그림 5)
열 안정성
다양한 화학물질의 영향 (표 1)
< h2 class="ttl_bigLine">응용 프로그램

이 효소는 임상 분석에서 관련 효소와 결합될 때 N-아세틸뉴라민산 및 시알산의 효소적 측정에 유용합니다. 57)
산업용으로 시알산의 효소합성에 유용한 효소입니다. 89)

분석

원칙

Principle

NADH의 소멸은 분광광도법으로 340nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 1개 단위는 분당 1마이크로몰의 NADH를 산화시킵니다.

방법

시약

A. NANA 용액50mM［309mg의 N-아세틸뉴라민산(MW=309)을 약. 50mM K-인산염 완충액(pH 7.5) 15ml를 넣고, 1N KOH로 pH 7.5로 조절한 후 같은 완충액으로 20ml까지 채운다.] (0~5℃에서 보관 시 최소 1주일 동안 안정함)
B. LDH 솔루션약. 50U/ml［돼지 심장 젖산탈수소효소(도요보 2등급, 황산암모늄 현탁액)를 약 100ml의 농도로 희석합니다. 50U/ml, 얼음처럼 차가운 50mM K-인산염 완충액, pH 7.5] (새로 준비해야 함)
C. NADH 용액1.0mM［NADH・Na2・3H2O(MW=763) 7.6mg을 50mM K-인산염 10ml에 녹입니다. buffer, pH 7.5] (새로 준비해야 함)
D. 완충 용액50mM K-인산염 완충액, pH 7.5
E. 효소 희석제50mM K-인산염 완충액, pH 7.5, 0.2% BSA 함유

절차

1.다음 반응 혼합물을 큐벳(d=1.0cm)으로 하고 37℃에서 평형화합니다. 약 5분간 담가주세요.

1.0ml기질 용액(A)
0.5mlLDH 용액(B)
0.5mlNADH 용액(C)
0.4ml완충 용액< /td>(D)
분석 혼합물의 농도
K- 인산염 완충액50 mM
NANA20mM
NADH0.2mM
LDH약 10U/ml
  • < th align="center" class="w20p">Residual activity(%)< td>0.10%
    ChemicalConcn.(mM)
    PCMB2.00
    NEM2.0103
    NaF2.0100
    NaN320100
    EDTA5.095
    o-Phenanthroline2.0100
    α,α′-Dipyridyl 2.0101
    Borate5086
    Triton X-1000.10%109
    Na-cholate95
    SDS0.10%0
    Tween 400.10%96
    Span 85 0.10%93
    • Ac, CH 3CO; PCMB, p-Chloromercuribenzoate; NEM, N-Ethylmaleimide; EDTA, Ethylenediaminetetraacetate; SDS, Sodium dodecyl sulfate.

    • Fig.1. Stability (Powder form)

      Fig.1. Stability (Powder form)

      (kept under dry conditions)

    • Fig.2. Stability (Powder form)

      Fig.2. Stability (Powder form)

      (kept under dry conditions)

    • Fig.3 . pH-Activity

      Fig.3. pH-Activity

      37℃, 5min-reaction in 50mM buffer solution : pH5.0-6.0, acetate; pH6.0- 9.0, K-phosphate; The enzyme activity was assayed by the 2,4-dinitroplenylhydradine method.

    • Fig.4. Temperature activity

      Fig.4. Temperature activity

      5min-reaction in 50mM K-phosphate buffer pH7.5, The enzyme activity was assayed by the 2,4-dinitroplenylhydradine method.

    • Fig.5. pH-Stability

      Fig.5. pH-Stability

      10℃, 25hr-treatment with 50mM buffer solution : pH4.0-6.0, acetate; pH6.0-9.0, K-phosphate ; pH9.0-10.0, borate.

    • Fig.6. Thermal stability

      Fig.6. Thermal stability

      30min-treatment with 50mM K-phosphate buffer, pH7.5, enzyme concentration.: 20U/ml

      • < /ul>

    활성 측정법(Japanese)

    1. 원리

    원리

    NADH의 소실량을 340nm의 흡광도 변화로 측정한다.

    2. 정의

    하기 조건으로 1분간에 1마이크로몰의 NADH가 산화되는 효소량을 1단위(U) 한다.

    3. 시약

    • 50mM NANA 용액 [309㎎의 N-아세틸노이라민산(MW=309)을 약 15ml의 50mM K-인산 완충액, pH 7.5에 용해하고, 1N KOH로 pH를 7.5로 조정 후, 같은 완충액으로 20ml로 한다](05℃ 보존으로 1주일은 사용 가능) /li>
    • LDH 용액[돼지 심장 LDH(도요보제 GradeⅡ, 황안 현탁액)을 50mM K-인산 완충액, pH 7.5로 약 50U/ml로 희석한다](용시 조제)< /li>
    • 1.0mM NADH 용액 [7.6㎎의 NADH·Na2·3H2O (MW=763)를 10ml의 50mM K-인산 완충 액, pH 7.5에 용해한다](용시 조제)
    • 50mM K-인산 완충액, pH7.5 K-인산 완충액, pH 7.5 (D)에 용해시키고, 분석 직전에 동일한 완충액으로 0.1 0.3U/ml로 희석한다.

    4. 절차

    1.아래 반응 혼합물을 큐벳 (d = 1.0cm)으로 제조하고 약 5 분 동안 예비 가온한다.

    1.0ml기질 용액(A)
    0.5mlLDH 용액(B)
    0.5mlNADH 용액(C)
    0.4ml K-인산 완충액(D)

    2. 효소 용액 0.1ml를 첨가하고, 완만하게 혼화 후, 물을 대조에 37℃로 제어된 분광 광도계로 340nm의 흡광도 변화를 34분간 기록하고, 그 초기 직선 부분으로부터 1분간 당의 흡광도 변화를 구한다 (ΔODtest).

    3.맹검은 반응혼액①에 효소 용액 대신에 효소 희석액(0.2%BSA를 포함한 50mM K-인산 완충액 , pH 7.5) 0.1ml를 첨가하고, 상기와 같이 조작을 행하여, 1분간당의 흡광도 변화를 구한다(ΔOD blank).

    5. 수식

    • U/ ml =

    • ΔOD/min (ΔOD testΔOD blank)×2.5ml× 희석 배율

      6.22×1.0×0.1(ml)

    < /tr>
    = ΔOD/min×4.02×희석 배율
    U/mg= U/ml× 1/C
    6.22: NADH의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm2/micromole)
    1.0: 광로 길이(cm)
    C: 용해 시 효소 농도(c㎎/ml)

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