TOYOBO BIO

진단시약원료 효소

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UREASE

준비 및 사양

< /table>

속성

외관	백색 무정형 분말, 동결건조
활동량	GradeII(-201) 100U/mg-solid 이상
오염물질	아스파라기나제	≤2.0×10^-2%
	아르기나제	≤2.0×10^-3%
	NH₄⁺	≤5.0×10^-4μg/U
안정제	EDTA, 글루타티온, 석시네이트, BSA

< td>50℃ 미만 (pH 8.0, 60분) (그림 6)

열 안정성
안정성	−20℃에서 안정적 최소 1년 동안 (그림 1)
분자량	대략. 480,000 ¹⁾
등전점	5.0−5.1 ¹⁾
미카엘리스 상수	1.05×10-2 M (요소) ¹⁾
구조	효소 분자당 SH 그룹이 있는 8개의 활성 부위 ²)
억제제	중금속 이온(Ag+,Hg++ 등)
최적 pH	6.0 (그림 3)
최적 온도	60℃ (그림 4)
pH 안정성	pH 5.5−8.5 ( 30℃, 17시간) (그림 5)
다양한 화학물질의 영향	(표 1)

응용

이 효소는 임상 분석에서 요소의 효소적 측정에 유용합니다.

분석

원리

Principle

NADPH의 소멸은 분광 광도법으로 340nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 하나의 단위는 분당 2마이크로몰의 암모니아를 형성합니다.

방법

시약

< tr>

아. 요소수	6.0M (요소 36g／H₂O 100ml)(신선하게 준비해야 함)
B. Tris-HCl 완충액, pH 8.0	50mM
C. α-케토글루타레이트 용액	0.25M (α-케토글루타레이트 730mg을 H₂O 15ml에 녹이고 pH를 5.0으로 조정) 5N NaOH로 ±0.1, H₂O로 최대 20ml까지 채움)(신선하게 준비해야 함)
D. NADPH 용액	15mM［NADPH 136mg・Na₄・4H₂O／10ml H2O를 녹인다］(준비해야 함 최신)
E. 작업 용액(사용 전 준비 및 얼음 위에 보관)	69ml	Tris-HCl 완충액	(B)
	0.3ml	α-케토글루타레이트 용액	(C)
	1.8ml	NADPH 용액	(D)
	0.9ml	H₂O< /td>
F. GlDH(글루타메이트 탈수소효소) 용액	ca.1,000U/ml［Toyobo GradeII,GTD-209(Tris-HCl 완충액, 무암모니아)]
G. 효소 희석제	20mM EDTA 및 0.2% BSA가 포함된 10mM K-인산염 완충액, pH 7.0

절차

1.다음 반응 혼합물을 큐벳(d=1.0cm)에 준비하고 37°C에서 평형화합니다. 약 5분 동안.

< td>효소 용액*

2.40ml	작업 솔루션	(E)
0.05ml	GlDH 용액	(F)
0.35ml	H₂O
0.10ml

< /tr>

분석 혼합물의 농도
Tris-HCl 완충액	38mM
우레아	200mM
α-케토글루타레이트	0.83mM
NADPH	0.30mM
EDTA	0.67mM
GlDH	약 17U/ml

2.요소수 0.10ml를 추가합니다( A) 부드럽게 뒤집어 혼합합니다.

3.500°C로 온도를 조절한 분광 광도계에서 3~4분간 물에 대한 340nm에서의 광학 밀도 감소를 기록합니다. 37℃, 곡선의 초기 선형 부분으로부터 분당 OD를 계산합니다(ODtest).
동시에 공백률(OD 공백)을 측정합니다. ) 효소용액 대신 효소희석액을 넣는 것을 제외하고는 시험방법과 동일하게 한다.

^*용해 얼음처럼 차가운 효소 희석제(G)에 효소 제제를 넣고 동일한 완충액으로 0.07−0.25U/ml로 희석하여 얼음 위에 보관합니다.

계산

다음 공식을 사용하여 활동을 계산할 수 있습니다:

볼륨 활동(U/ml) =
ΔOD/min(ΔOD 테스트−ΔOD 공백)×Vt×df
6.22×2×1.0×Vs
= ΔOD/min×2.41×df

체중 활동량(U/mg) = ( U/ml)×1/C

Vt	: 총 용량(3.0ml)< /td>
Vs	: 샘플량(0.10ml)
6.22	: 340nm에서 NADPH의 밀리몰 흡광계수(cm²/마이크로몰)
2	: 다음 사실에 기초한 인자 요소 1몰의 가수분해는 NADPH 2몰의 산화와 동일합니다.
1.0	: 빛의 경로 길이(cm)
df	: 희석 인자
C	: 용해 시 효소 농도(c mg/ ml)

참조

1) JBSumner 및 DBHand; J.Am.Chem.Soc., 31, 1255(1929)

2) G.Gorin 및 CCChin; Biochim.Biophys.Acta., 99, 418 (1965)

3) 린쇼카가쿠분세키(일본어),Ⅱ,p18(M.Kitamura, M.Saito 및 M.Niwa, ed.) Tokyo Kagaku Dojin, Tokyo(1969)

4) HGschlegel 및 H.Kaltwasser; 효소 분석 방법, Vol.2,p1081(HUBergmeyer,ed.), Verlag Chemie Weiheim, Acdemic Press, New York-London (1974)

표 1 UREASE에 대한 다양한 화학물질의 효과

[20mM 인산염 완충액(pH 7.0)에 용해된 효소를 30°C에서 각 화학물질과 함께 배양했습니다. 1시간 동안.]

< tr>
화학물질 농도(mM) 잔류
활동(%)
없음 - 100
NaCl 10 96
나₂SO₄ 10 104
CH₃COONa 10 108
Na_2HPO₄ 10 100
구연산염-Na₂ 10 100
Na₂CO₃ 10 100
나₃BO₄ 10 104
나₃S₂O₄ 10 108
< /tr>< tr>
화학 th> 농도(mM) 잔류
활성도(%)
MnCl₂ 1.0 66
MgCl₂ 1.0 97
CaCl_{2< /sub>} 1.0 105
ZnCl₂ 1.0 104
FeSO₄ 1.0 94
CuSO₄ 1.0 99
Ag₂SO₄ 0.1 9
HgCl< sub>2 0.1 8

화학물질	농도(mM)	잔류 활동(%)
없음	-	100
NaCl	10	96
나₂SO₄	10	104
CH₃COONa	10	108
Na_2HPO₄	10	100
구연산염-Na₂	10	100
Na₂CO₃	10	100
나₃BO₄	10	104
나₃S₂O₄	10	108

화학 th>	농도(mM)	잔류 활성도(%)
MnCl₂	1.0	66
MgCl₂	1.0	97
CaCl_{2< /sub>}	1.0	105
ZnCl₂	1.0	104
FeSO₄	1.0	94
CuSO₄	1.0	99
Ag₂SO₄	0.1	9
HgCl< sub>2	0.1	8

그림 1. Stability (Powder form)
(kept under dry conditions)
Fig.2. Stability (Powder form)
(kept under dry conditions)
Fig.3. pH-Activity
30℃ in 10mM buffer solution: pH3.0- 9.0 Veronal-CH₃COONa-HCI; pH9.0-11.0, glycine-NaOH.
Fig.4. Temperature activity
( in 20mM phosphate buffer,pH7.0)
Fig.5. pH-Stability
30℃ ,17hr-treatment with 10mM buffer solution: pH 3.0- 9.0, Veronal-CH₃COONa-HCI; [pH9.0-11.0: glycine-NaOH
Fig.6. Thermal stability
60min-treatment with 20mM phosphate buffer, pH8.0.

활성 측정법(Japanese)

1. 원리

원리 NADPH의 감소량은 340 nm에서의 흡광도 변화로 측정된다. </p><p class= 2. 정의

하기 조건 하에서 1분 동안 2 마이크로몰의 암모니아를 생성한다(1 마이크로몰의 우레아 가수 분해) 효소량을 1단위(U)로 한다.

3. 시약

6.0M 우레아 수용액(36g의 우레아를 증류수에 용해시켜 100ml로 한다)( (용시 조제)
50mM Tris-HCl 완충액, pH8.0
0.25M α-케토글루타르산 수용액(730㎎의 α-케토글루타르산을 증류수 약 15ml로 용해하고, 5N NaOH로 pH 5.0±0.1로 조제한 후, 증류수로 20ml로 한다)(용시 조제) 10ml에 용해한다](용시 조제)
시약 혼합액(사용 직전에 조제하고, 빙냉 보존한다) >69.0mlTris-HCl 완충액(B)0.3 mlα-케토글루타르산 수용액(C)1.8mlNADPH 수용액(D)0.9ml증류수
글루탐산 탈수소효소(GlDH) 용액[도요보제, GTD-209(약 1,000U/ml에 증류수로 희석하여 사용한다)]

효소 용액: 효소 표품을 미리 빙냉한 20mM EDTA와 0.2% BSA를 포함하는 10mM K-인산 완충액, pH 7.0으로 용해하고, 같은 완충액으로 0.07 ~ 0.25U / ml로 희석하여 얼음 냉 보관한다.

4. 절차

1. 하기 반응 혼합물을 큐벳(d=1.0cm)으로 제조 37 ~ 약 5 분간 예비 가온한다.

2.40ml	시약 혼합액	(E)
0.05ml	GlDH 용액	(F)
0.35ml	증류수
0.10ml	효소 용액< /td>

2.기질 용액(A) 0.10ml를 첨가하고 부드럽게 혼합 한 후, 물을 대조군으로 37 ℃로 제어 한 분광 광도계로 340 nm의 흡광도 변화를 3 ~ 4 분간 기록하고, 초기 직선 부분으로부터 1 분당 흡광도 변화를 구한다 (Δ ODtest).

3. 맹검은 반응 혼합액으로 효소 용액 대신 효소 희석액(20mM EDTA를 포함하는 10mM K-인산 완충액, pH 7.0)을 0.10ml 첨가하고, 상기와 같이 조작하여 1 분당 흡광도 변화를 구한다 (ΔODblank).

5. 수식

U/ml=
ΔOD/min (ΔOD test−ΔOD blank)×3.0(ml)× 희석 배율
6.22×2×1.0×0.10(ml)

	= ΔOD/min×2.41×희석 배율
U/mg	= U/ ml×1/C
6.22	: NADPH의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm²/micromole)
2	: 효소 반응에서 1분자의 우레아의 가수분해로부터 유래하는 NADPH의 산화는 2분자인 것에 의한 계수
1.0	: 광로 길이(cm)
C	: 용해 시 효소 농도 (c mg/ml)