진단시약원료 효소

SARCOSINE OXIDASE

준비 및 사양

< th align="left" class="w33p">활동
성상황색 무정형 분말, 동결건조
GradeⅢ 8.0U/mg-solid 이상
오염물질카탈라제≤1.0%
안정제염화칼륨

속성

안정성 −20℃에서 안정적 최소 1년 동안 (그림 1)
분자량 약 43,000(SDS-PAGE 기준)
등전점 4.8±0.1
미카엘리스 상수 2.8×10-3 M
억제제 Cu＋＋, Ag＋, Hg＋＋, p-클로로머쿠리벤조에이트, N-에틸말레이미드, SDS
최적 pH 7.5−8.5 (그림 2)
최적 온도 55−60℃ (그림 3)
pH 안정성 6.0−9.5(25& #x2103;, 20시간) (그림 4)
열 안정성 60℃ 이하 (pH 7.5, 30분) (그림 5)
다양한 화학물질의 영향 (표 1)
< h2 class="ttl_bigLine">응용 프로그램

이 효소는 크레아티닌 아미도가수분해효소(CNH-211)와 결합될 때 크레아티닌, 크레아틴 및 사르코신의 효소적 측정에 유용합니다. , CNH-311) 및 크레아틴 아미디노가수분해효소(CRH-211, CRH221, CRH-229)

분석

원칙

< p class="mt10 imgAuto">Principle

단위 정의

하나의 단위는 다음을 형성합니다. 아래 설명된 조건에서 분당 과산화수소 1마이크로몰(퀴논이민 염료의 0.5마이크로몰)을 주입합니다.

방법

시약

< tr>< /tr>< tr>
아. 사르코신용액0.2M［사르코신(MW=89.09) 1.78g을 0.125% Triton X-100을 함유하는 pH 8.0의 0.125M TrisHCl 완충액 80ml에 녹이고, 2℃에서 pH 8.0으로 조정한 후 25℃ 1.0N NaOH 또는 1.0N HCl로 H2O로 최대 100ml까지 채웁니다.](0−5℃에서 보관하면 1주일 동안 안정함)
나. 4-AA 용액0.1%(4-아미노안티피린 100mg/H2O 100ml)(갈색 병에 담아 4℃에 보관)
C. 페놀용액0.1%(페놀 100mg/H2O 100ml)(갈색병에 담아 4℃에 보관)
디. 퍼옥시다제 용액0.025%［퍼옥시다제 25mg(110 퍼푸로갈린 단위/mg)/H2O 100ml](신선하게 준비해야 함)
E. SDS 용액0.25%(도데실황산나트륨 1.25g/H2O 500ml)
F. 효소 희석제20mM Tris-HCl 완충액, 2.0mM EDTA를 함유한 pH8.0

절차

1.다음 작업 솔루션(100개 테스트)을 준비합니다. 갈색 병에 담아 얼음 위에 보관하세요.

50ml사르코신 용액(A)
10ml4-AA 용액(B)
20ml페놀 용액(C)
20ml과산화효소 용액 (D)
th>
분석 혼합물의 농도
Tris-HCl 완충액48 mM
사르코신95 mM
4-아미노안티피린0.47mM
페놀2.0mM
Triton X-1000.045%
POD약 5.2U/ml

2.작업 용액 1.0ml를 피펫으로 옮깁니다. 시험관에 넣고 37°C에서 평형을 이룬다. 약 5분 동안.

3.효소 용액* 0.05ml를 넣고 섞으세요.

4.37°에서 정확히 10분 후 SDS 용액(E) 2.0ml를 첨가하여 반응을 중지하고 물에 대해 500nm에서 광학 밀도를 측정합니다(OD 테스트).< br>동시에 효소용액(OD 공백) 대신 효소희석액을 사용하는 것을 제외하고는 시험방법과 동일한 방법으로 공백을 준비한다.

*분석 직전에 효소 제제를 얼음처럼 차가운 효소 희석제(F)에 녹이고 동일한 완충액으로 0.07−0.17U/ml로 희석합니다.

계산

활동은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다.

  • 부피 활동(U/ml) =

  • ΔOD(OD 테스트−OD 공백)×Vt×df

    13.3×1/2×1.0×t×Vs

  • = ΔOD×0.917×df

웨이트 활동 (U/mg) = (U/ml)×1/C

< td>: 분석 조건 하에서 퀴논이민 염료의 밀리몰 흡광 계수(cm2/마이크로몰)
Vt: 총 용량(3.05ml) )
대: 샘플량(0.05ml)
13.3
1/2 : H2O2 1몰이 퀴논이민 염료 0.5몰을 생성한다는 사실에 근거한 인수
t : 반응 시간(10분)
1.0: 빛의 경로 길이(cm)
C: 용해 시 효소 농도(c mg/ml)

참조

1) N.Mori, M.Sato, Y.Tani 그리고 Y.야마다; Agric.Biol.Chem., 44, 1391 (1980).

2) M.Suzuki; J. Biochem., 89, 599(1981).

3) M.Suzuki 및 M.Yoshida; 화학 생리학 및 병리학 심포지엄 간행물(교토), Vol16, p.220(1976).

4) T.Kinoshita 및 Y. 히라가; Chem.Pharm.Bull., 28, 3501 (1980).

5) Y.Nishiya, S.Zuihara 및 T.Imanaka; 응용 및 환경 미생물학., 61, 367(1995).

표 1. Effect of Various Chemicals on Sarcosine oxidase

[The enzyme dissolved in 50mM K-phosphate buffer, pH 7.5 (10U/ml) was incubated at 30℃ for] 30min p>

  • < td>0.4< tr>< td>101
    ChemicalConcn.(mM)Residual
    activity(% )
    None-100
    Metal salt2.0
    MgCl 299
    CaCl2 99
    Ba(OAc)298
    FeCl399
    CoCl298
    MnCl299
    Zn(OAc)2< /td>98
    Cd(OAc)299
    NiCl296
    CuSO443
    Pb(OAc)2 98
    AgNO3
    HgCl20.4
    PCMB2.036
    MIA2.0
  • < tr>< td>74
    ChemicalConcn.( mM)Residual
    activity(%)
    NAF< /td>2.099
    NaN320.0 90
    EDTA5.097
    o -Phenanthroline2.099
    α,α′-Dipyridyl2.097
    Borate5098
    IAA2.097
    NEM2.0
    Hydroxylamine2.097
    Triton X -1000.10%99
    Brij 350.10%99
    Tween 200.10%97
    Span 200.10%101
    Na-cholate0.10%99
    SDS0.05%68
    DAC< /td>0.05%97

Ac, CH3CO; PCMB, p-Chloromercuribenzoate; MIA, Monoiodoacetate; EDTA, Ethylenediaminetetraacetate;
IAA, Iodoacetate; NEM, N-Ethylmaleimide; SDS, Sodium dodecyl sulf Dimethylbenzylalkylammonium chloride.

  • Fig.1 (Powder form)

    Fig.1. Stability (Powder form)

    (kept under dry conditions)

    < /li>

  • Fig.2. pH-Activity

    Fig.2. pH-Activity

    37℃ in 0.1M buffer solution : pH6.5-7.5 K-phosphate,:pH7.5-8.5 Tris-HCl : pH8.5-9.5 Glycine-NaOH

  • Fig.3. Temperature activity

    Fig.3. Temperature activity

    (in 0.1M Tris-HCI buffer : pH8.0)

  • Fig.4. pH-Stability

    Fig.4. pH-Stability

    25℃,24hr-treatment with 100mM buffer solution:pH5-6 Acetate buffer, :pH6-8 K-phosphate,: pH8-9 Tris-HCl, :pH8.5-9.5 Glycine-NaOH

  • Fig.5. Thermal stability

    Fig.5. Thermal stability

    30min-treatment with 50mM K-phosphate pH7.5 (contg. 100mM NaCl) enzyme concn. 5U/ml

활성 측정법(Japanese)

1. 원리

원리

4-Aminoantipyrine과 Phenol의 산화 축합물인 Quinoneimine 염료를 500nm에서 측정하고, 상기 반응에서 생성된 H2O2양을 정량한다.

2. 정의

하기 조건 하에서 1분에 1 마이크로몰의 H2O2를 생성하는 효소량을 1단위(U) 한다.

3. 시약

  • 0.2M 사르코신 용액[1.78g의 사르코신(MW=89.09)을 80ml의 0.125% Triton X-100을 포함한 0.125M Tris-HCl 완충액, pH 8.0에 용해 후, 1.0N NaOH 또는 HCl로 pH를 8.0으로 조정(25℃)하고, 증류수로 100ml로 한다](0 ~ 5 & # x 2103; 1 주일 동안 보관할 수 있음) x2103; 보존)
  • 0.1% 페놀 수용액(100mg 페놀을 100ml 증류수에 용해) 퍼 옥시다아제 (POD) (110 풀 프로 갈린 단위 / mg)를 증류수 100ml에 용해한다. 물에 용해]

효소 용액: 효소 표품을 미리 빙냉한 2.0mM EDTA를 포함하는 20mM Tris-HCl 완충액, pH 8.0에서 용해 , 분석 직전에 같은 완충액으로 0.07~0.17U/ml로 희석한다.

4. 절차

1. 저장).

50ml사르코신 용액(A)
10ml4-AA 수용액(B)
20ml페놀 수용액(C)
20mlPOD 수용액 (D)

2. 반응 혼합물 1.0ml 시험 튜브에 채취하여 약 5 분 동안 예비 가온한다.

3. 효소 용액 0.05ml를 첨가하여 반응을 개시한다.

4.37℃에서 정확하게 10분간 반응시킨 후, SDS 수용액(E) 2.0ml를 첨가하여 반응을 정지시킨다 . 이 용액에 대해 500nm에서의 흡광도를 측정한다 (OD test).

5. 맹검은 효소 용액 대신 효소 희석액 (2.0 mM EDTA를 포함하는 20 mM Tris-HCl 완충액, pH 8.0) 를 사용하여 상기와 같이 조작하여 흡광도를 측정한다 (OD blank).

5. 수식

  • U/ml =< /p>

  • ΔOD(OD test-OD blank)×3.05(ml)×희석 배율

    13.3×1/2×1.0×10(분)×0.05(ml)

= ΔOD×0.917×희석 배율
U/mg= U/ml×1/ C
13.3: Quinoneimine 염료의 상기 측정 조건 하에서 밀리몰 분자 흡광계(cm2/micromole)
1/2: 효소 반응에서 생성된 H2O2 중 1 분자로 형성되는 Quinoneimine 염료는 1/2 분자인 것에 의한 계수 tr>
C: 용해 시 효소 농도(c mg/ml)

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