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진단시약원료 효소

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PURINE-NUCLEOSIDE PHOSPHORYLASE

준비 및 사양

외관	백색 무정형 분말, 동결건조백색 무정형 분말, 동결건조
활동성	GradeⅢ 15U/mg-solid 이상
오염물질	카탈라제	≤20%
	5'-뉴클레오시다제	≤1.0x10^-3%
	아데노신 탈아미노효소	≤1.0x10^-3%
	ATPase	≤1.0x10^-2%
안정제	K-글루코네이트, 만니톨 , EDTA

속성

< td>60℃ 미만 (pH 7.7, 30분) (그림 6)

열 안정성
안정성	−20℃에서 안정적 최소 1년 동안 (그림 1)
분자량	대략. 120,000
등전점	4.1±0.1
미카엘리스 상수	6.4×10^-5 M(이노신), 3.2×10^-4 M(Pi)
억제제	p-클로로머쿠리벤조에이트, SDS, Hg^＋＋, Ag^＋
최적 pH	7.5−8.0 (그림 3)
최적 온도	65℃ (그림 4)
pH 안정성	pH 6.0−9.0 ( 30℃, 16시간) (그림 5)
기질 특이성	(표 1)
다양한 화학물질의 영향	(표 2)

애플리케이션 3~5 )

이 효소는 크산틴 산화효소(XTO-212) 및 유리카제(UAO-201, UAO211)

분석

원칙

Principle

요산의 출현은 분광광도법으로 293nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 1단위는 분당 1마이크로몰의 요산을 형성합니다.

방법

시약

< /tr>

아. K-인산염 완충액, pH 7.7	50mM
B. 이노신 용액	32mM［85.8mg의 이노신(MW=268.23)을 10ml의 H2O에 가열하여 녹입니다.］(4℃에 보관하면 최소 2주 동안 안정함)
다. 잔틴산화효소 용액	ca.6.6U/ml［얼음처럼 차가운 완충액 A를 사용하여 잔틴산화효소(XTO-212)를 약6.6U/ml로 녹입니다.］(신선하게 준비해야 함)
디. 효소 희석제	버퍼 A

절차

1.다음 반응 혼합물을 큐벳(d=1.0cm)에 준비하고 37℃에서 평형화합니다. 약 5분 동안

2.7ml	K-인산염 완충액, pH 7.7	(A)
0.2ml	기질 용액	(B)
0.1ml	크산틴 산화효소 용액	(C)

분석 혼합물의 농도
K-인산염 완충액	ca .47mM
이노신	2.1mM
크산틴 산화효소	ca. 0.2U/m

2.0.05ml의 효소 용액*을 추가하고 가볍게 뒤집어 섞습니다.

3.물에 대한 293nm에서 광학 밀도 감소를 기록합니다. 37°로 온도 조절된 분광 광도계에서 3~4분 동안 측정하고 곡선의 초기 선형 부분에서 분당 OD를 계산합니다(OD 테스트).
동시에 측정합니다. 효소용액 대신 효소희석액을 넣는 것을 제외하고는 시험과 동일한 방법으로 공시험률(ΔOD 공백)을 측정합니다.

^*효소제를 얼음처럼 차가운 효소희석액(D)에 녹이고, 같은 완충액으로 0.1−1.5U/ml로 희석하여 얼음 위에 보관합니다.

계산

활동은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다:

활동량(U/ml) =
ΔOD/min (ΔOD 테스트−ΔOD 공백)×Vt×df
12.5×1.0×Vs
= ΔOD/min×4.88×df

체중 활동도(U/mg) = (U/ml)×1/C

< td>: 광선 길이(cm)

Vt	: 합계 용량(3.05ml)
Vs	: 샘플 용량(0.05ml)
12.5< /td>	:분석 조건에서 요산의 밀리몰 흡광 계수(cm²/마이크로몰)
1.0
df	: 희석 계수
C< /td>	: 용해시 효소 농도(c mg/ml)

< h2 class="ttl_box">참조

1) REParks, Jr. 및 RPAgarwal; The Enzymes, Vol.7, p483(3판)(1972)

2) PAHoffe, R.May 및 BCRobertson; Methods in Enzymology, Vol.11, p70(1972)

3) Y.Machida 및 T. Nakanishi; Agric.Biol.Chem.,45, 1801 (1981)

4) M.Sugiura, K.Kato, T.Adachi, Y.Ito , K.Hirano 및 S.Sawaki; Chem.Pham.Bull.,29, 1451 (1981)

5) P.Fossati; Analytical Biochemistry.,149, 62 (1985)

표 1. 퓨린-뉴클레오시드 포스포릴라제의 기질 특이성^{3)< /sup>}

[이노신: 퓨린-뉴클레오사이드 포스포릴라제 - 크산틴 산화효소 시스템, pH 7.7 구아노신, 아데노신, ATP, 티미딘: UV 시스템, pH 7.4]

기판 (0.2mM) 상대활성도(%)
이노신 100
구아노신 41
아데노신 0
기질(0.2mM) 상대활성도(%)
ATP 0
티미딘 0< /td>

기판 (0.2mM)	상대활성도(%)
이노신	100
구아노신	41
아데노신	0

기질(0.2mM)	상대활성도(%)
ATP	0
티미딘	0< /td>

표 2. Effect of Various Chemicals on Purine-nucleoside phosphorylase

[The enzyme dissolved in 50mM PIPES buffer, pH 7.0 (10U/ml) was incubated with each chemical at13hr& ]

< td>MgCl₂< /tr>
Chemical Concn.(mM) Residual
activity(%)
None - 100
Metal salt 2.0
90.1
CaCl₂< /td> 96.7
Ba(OAc)₂ 93.4
FeCl₃ 73.9
MnCl₂ 95.0
ZnCl₂ 77.6
NiCl₂ < /td> 94.1
CuSO₄ 9.8
Pb(OAc)₂ 9.1
AgNO₃ 0.5
HgCl₂ 0.1

Chemical	Concn.(mM)	Residual activity(%)
None	-	100
Metal salt	2.0
	90.1
CaCl₂< /td>		96.7
Ba(OAc)₂		93.4
FeCl₃		73.9
MnCl₂		95.0
ZnCl₂		77.6
NiCl₂	< /td>	94.1
CuSO₄		9.8
Pb(OAc)₂		9.1
AgNO₃		0.5
HgCl₂		0.1

< tr>< tr>

Chemical	Concn.(mM)	Residual activity(%)
N-ethylmaleimide	2.0	91.9
NaF	2.0< /td>	90.9
NaN₃	20	95.7
EDTA	5.0	96.8
o-Phenanthroline	2.0	98.3
Borate	50	9.0
Iodoacetamide	2.0	98.7
Triton X-100	0.10%< /td>	138.4
Na-cholate	0.10%	124.4
SDS	0.10%	0.1
Span 20	0.10%	128.9

EDTA, Ethylenediaminetetraacetate; SDS, Sodium dodecyl sulfate.

Fig.1. Stability (Powder form)
(kept under dry conditions)
Fig.2. Stability (Powder form)
(kept under dry conditions)
Fig.3. pH-Activity

in 50mM buffer solution: pH 4-6, acetate; pH 6-8, K-phosphate; pH 7-9, Tris-HCl; pH 9-10, Borate
그림 .4. Temperature activity
(in 50mM K-phosphate buffer, pH 7.7)
< img src="images/PNP_311_img04.jpg" alt="Fig.5. pH-Stability">
Fig.5. pH-Stability
30℃, 16hr-treatment with 50mM buffer solution: pH 4-6, Acetate; pH 6-8, K-phosphate; pH 7-9, Tris-HCl; pH 9-10, Borate; pH10- 12, Glycine-NaOH. Enzyme concentration: 10U/ml
Fig.6. Thermal stability
30min-treatment with 50mM K-phosphate buffer, pH 7.7. Enzyme concentration : 1U/ml

활성 측정법(Korean)

1. 원리

2. 정의

하기 조건 하에서 1분에 1마이크로몰의 요산을 생성하는 효소량을 1단위(U) 한다.

3. 시약

50mM K-인산 완충액, pH 7.7
32mM 이노신 수용액 〔85.8mg의 이노신(MW=268.23)을 10ml의 증류수에 가온 용해한다〕(4℃ 보존으로 2주간은 사용 가능) 탁 결정 효소 (약 20U / ml)를 얼음 냉각 완충액 A로 약 6U / ml로 희석한다. 품을 미리 빙냉한 50mM K-인산 완충액, pH 7.7로 용해하고, 같은 완충액으로 0.1~1.5U/ml로 희석하여 빙냉 보존한다.
4. 절차
1. 하기 반응 혼합물을 큐벳(d=1.0cm)으로 제조 37 ~ 약 5 분간 예비 가온한다.
2.7ml K-인산 완충액 (A)
0.20ml 기질 용액 (B)
0.10ml 크산틴 옥시다아제 용액 (C)
2. 효소 용액 0.05ml를 첨가하고, 완만하게 혼화 후, 물을 대조에 37℃로 제어된 분광 광도계로 293nm의 흡광도 변화를 3~ 4 분 동안 기록하고 초기 직선 부분에서 분당 흡광도 변화를 찾습니다 (ΔODtest).

3. 맹검은 반응 혼합액으로 효소 용액 대신 효소 희석액(50 mM K-인산 완충액, pH 7 .7) 0.05ml를 첨가하고, 상기와 같이 조작하여 1 분당 흡광도 변화를 구한다 (ΔODblank).
5. 수식
- U/ml =< /p>
- ΔOD/min (ΔOD test−ΔOD blank)×3.05(ml) × 희석 배율
  12.5×1.0×0.05(ml)
= ΔOD/min×4.88×희석 배율
U/mg = U/ml ×1/C
12.5 : 요산의 밀리몰 분자 흡광계수(cm²/micromole)< /td>
1.0 : 광로 길이(cm)
C : 용해시 효소 농도(c mg/ml)

2.7ml	K-인산 완충액	(A)
0.20ml	기질 용액	(B)
0.10ml	크산틴 옥시다아제 용액	(C)

	= ΔOD/min×4.88×희석 배율
U/mg	= U/ml ×1/C
12.5	: 요산의 밀리몰 분자 흡광계수(cm²/micromole)< /td>
1.0	: 광로 길이(cm)
C	: 용해시 효소 농도(c mg/ml)