진단시약원료 효소

< img src="/inday_fileinfo/img/v520240422194449.">

준비 및 사양

< table class="darkGray"> 외관 연청색 무정형 분말, 동결건조< /tr> 활동 GradeⅢ 200U/mg-solid 이상
(안정제 약 70% 함유) 오염물질 카탈라제 ≤1.0×10-1 %포스파타제≤2.0×10-2% 안정제 BSA, 붕사, 기본 아미노산.

응용 프로그램

이 효소는 아스코르브산의 효소적 측정과 임상 분석에서 아스코르빈산의 간섭을 제거하는 데 유용합니다.< /p>

분석

원칙

Principle

아스코르빈산의 소멸은 분광광도법으로 245nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 1단위는 분당 1마이크로몰의 아스코르브산을 감소시킵니다.

방법

시약

< /table>

절차

1.다음 반응 혼합물을 시험관에 준비하고 30°C에서 평형을 이루게 합니다. 약 5분간 담가주세요.

A. 아스코르빈산 용액1.0mM ［원액(10mM)을 1.0mM이 포함된 0.2M KH2PO4 용액으로 10배 부피로 희석합니다. EDTA.](새로 준비)
원액 : 176mg L-아스코르브산(MW=176.13)/1.0mM EDTA를 함유한 1.0mM HCl 용액 100ml(0−5℃에서 보관하면 1개월 동안 안정함)< /td>
B. Na2HPO4 용액10mM
C. HCl 용액0.2N
D. 효소희석제10mM Na2HPO4 0.05% BSA 함유 용액(갓 준비)
0.5ml기질 용액(A)
0.5mlNa2HPO4 용액 (B)
(반응 혼합물의 pH는 5.6이어야 합니다.)
분석 혼합물의 농도
KH2PO482mM
Na2HPO45.5mM
아스코르브산0.45mM
EDTA0.45mM
BSA45.4μg/ml

2.효소 용액* 0.1ml를 넣고 섞습니다.

3.정확히 5분 후 30℃, HCl 용액(C) 3.0ml를 첨가하여 반응을 정지시키고 물에 대한 245nm에서 흡광도를 측정한다(OD 테스트).
동시에 반응 혼합물을 먼저 혼합하여 바탕액을 준비한다. 30℃에서 5분간 배양한 후 HCl 용액(C) 3.0ml를 첨가한 후 효소 용액(OD 공백)을 첨가합니다.

*효소 제제를 얼음처럼 차가운 증류수(60U/ml 이상)에 녹이고 분석 직전에 얼음처럼 차가운 효소희석액(D)을 사용하여 0.15−0.25U/ml로 희석합니다.< /p>

계산

다음 공식을 사용하여 활동을 계산할 수 있습니다.

  • 볼륨 활동(U/ml) =

  • ΔOD(OD 공백-OD 테스트)×Vt×df

    10.0×1.0×t×Vs

= ΔOD×0.820×df

체중 활성도(U/mg) = (U/ml) ×1/C

< /tr>
Vt: 총 용량(4.1ml)
Vs: 시료량(0.1ml)
10.0: 밀리몰 흡광계수 pH 1.0의 분석 조건에서 아스코르브산의 양(cm2/마이크로몰)
1.0: 빛의 경로 길이( cm)
t: 반응 시간(5분)
df : 희석 인자
C: 용해 시 효소 농도(c mg/ml)

참조

1)T.Nakamura, N.Makino 및 Y.Ogura; J.Biochem., 64,189(1968).

2)V.Ts.Aikazyan 및 RMNalbandyan; FEBS LETTERS, 104,127(1979).

3)GAWhite 및 FGSmith; Nature, 190,187(1961).

표 1. Effect of Various Chemicals on Ascorbate oxidase

[The enzyme dissolved in distilled water (60U/ml) was incubated with each chemical at 25℃ for 1hr.]

< ul class="picList">
  • < tr>
    Chemical Concn.(mM)Residual activity(%)
    None-100
    Metal salt2.0
    MgCl288
    CaCl286
    Ba(OAc)286
    FeCl334
    CoCl283
    MnCl288
    ZnCl290
    CdCl287
    NiCl2 79
    CuSO4< /td>90
    Pb(OAc)291
    AgNO33.7
    HgCl242
    2-Mercaptoethanol2.0< /td>75
    PCMB1.026
  • < tr>< td>84
    ChemicalConcn.(mM)Residual 활동(%)
    MIA2.03.5
    NEM2.075
    IAA2.0 21
    Hydroxylamine2.081
    EDTA 5.080
    o-Phenanthroline2.050< /td>
    α,α′-Dipyridyl1.078
    Borate5075
    NaF2.0
    NaN32.085
    Triton X-1000.10%84
    Brij 35 0.10%24
    Tween 200.10%19
    Span 200.10%97
    Na-cholate 0.10%80
    SDS0.05%83
    DAC0.05%88
    • Ac, CH3CO; PCMB, p-Chloromercuribenzoate; MIA, Monoiodoacetate; NEM, N-Ethylmaleimide; IAA, lodoacetamide;
    EDTA, Ethylenediaminete SDS, Sodium dodecyl sulfate; DAC, Dimethylbenzylalkylammonium chloride.

    • Fig.1. Stability (Powder form)

      (kept under dry conditions)

    • Fig.2. Stability (Powder form)

      Fig.2. Stability (Powder form)

      (kept under dry conditions)

    • Fig.3. Stability (Liquid form)

      Fig.3. Stability (Liquid form)

      enzyme concn. :8,000U/ml buffer composition:45mM borate buffer,pH7.8

    • Fig.4. pH-Activity

      Fig.4. pH -Activity

      30℃ in 0.33 M buffer solution: pH3.0-6.0,acetate; pH5.0-8.0, phosphate

    • Fig.5. Temperature activity

      Fig.5. Temperature activity

      (in 0.33M phosphate buffer,pH5.6)

    • Fig.6. pH-Stability

      Fig.6. pH-Stability

      25&# x2103;, 17hr-treatment with Britton-Robinson's buffer

    • Fig.7. Thermal stability

      Fig.7. Thermal stability

      30min-treatment with 50mM phosphate buffer,pH 8.0 enzyme concn.: 12U/ ml

    활성 측정법(Japanese)

    1. 원리

    원리

    < Ascorbic acid의 소실량을 245nm의 흡광도 변화로 측정한다.

    2. 정의

    하기 조건 하에서 1분에 1마이크로몰의 아스코르브산을 산화하는 효소량을 1단위(U )로 한다.

    3. 시약

    • 1.0mM 아스코르브산 용액 [보존 용액(10mM의 L-아스코르브산 용액)을 1.0 mM EDTA를 포함하는 0.2M KH2PO4 용액으로 10배 희석한다.(용시 조제) 보존 용액은 176mg의 L-아스코르브산 특급, MW=176.13)을 정칭하고 1.0mM EDTA를 포함하는 1.0mM HCI 용액 100ml에 용해하여 조제한다(0~5℃ 보존으로 1개월은 사용 가능).
    • 10mM Na2HPO4용액
    • 0.2N HCl 용액

    효소 용액: 효소 표제를 미리 빙냉한 증류수로 용해(60U/ml 이상)하고, 분석 직전에 0.05% BSA를 포함하는 10mM Na2HPO4 용액(빙냉)으로 0.15~0.25U/ml로 희석한다.

    4. 절차

    1. 시험관에 다음 반응 혼합물을 준비하고 30 ℃에서 약 5 분 동안 예비 가온한다.

    0.5ml기질 용액(A)
    0.5mlNa2HPO4 용액 < /td>(B)
    (반응 혼합물의 pH는 5.6)

    2. 효소 용액 0.1ml를 첨가하여 반응을 개시한다.

    3.30℃에서 정확하게 5분간 반응시킨 후, HCl 용액(C) 3.0ml를 첨가하여 반응을 정지시킨다 . 이 액체 당 245 nm에서의 흡광도를 측정한다 (ODtest).

    4.맹검은 반응혼액 1을 30℃으로 5분간 방치한 후, HCl 용액(C) 3.0ml를 첨가하여 혼화 그런 다음 효소 용액 0.1ml를 첨가하여 준비한다. 이하와 같이 흡광도를 측정한다 (ODblank).

    5. 수식

    • U/ ml =

    • ΔOD(OD blank-OD test)×4.1(ml)×희석 배율

      10.0×1.0×5(분)×0.1(ml)

    < td>= ΔOD×0.82× 희석 배율
    U/mg= U/ml×1/C
    10.0: 아스코르브산의 상기 측정 조건하(pH1.0)에서의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm2/micromole)
    1.0: 광로 길이(cm)
    C : 용해시 효소 농도 (c mg/ml)

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