진단시약원료 효소

PYRUVATE OXIDASEE

준비 및 사양

< th align="left">활동
외관 황색 무정형 분말, 동결건조
GradeⅢ 1.5U/mg-solid 이상
오염물질 ATPase ≤5.0×10-2%
GOT, GPT ≤5.0×10-2%
안정제 설탕, 유행 td>

속성< /h2>
< td>45℃ 미만 (pH 6.0, 15분) (그림 5)
안정성 −20&에서 안정적 #x2103; 최소 1년 동안 (그림 1)
분자량 대략. 260,000
등전점 4.3
미카엘리스 상수 3.4×10-4 M(피루브산)
억제제 Fe++,Zn++,Cu++,Ag+,Hg++
최적 pH 5.7 (그림 2)
최적 온도 65℃ (그림 3)
pH 안정성 pH 5.7−6.5 ( 25℃, 20시간) (그림 4)
열 안정성
기질 특이성 (표 1)
다양한 화학물질의 영향 (표 2)

애플리케이션

이 효소는 임상 분석에서 피루브산, GOT, GPT의 효소 측정에 유용합니다.

분석

< div class="mb30">

원칙

Principle

퀴노네이민 염료의 외관은 분광광도법으로 550nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 1개 단위는 분당 1마이크로몰의 과산화수소(퀴논이민 염료의 0.5마이크로몰)를 형성합니다.

< /div>

방법

시약

< th align="left">F. FAD 용액< align="left">G. EDTA 용액
A. 피루브산 용액0.3M[피루브산 378mg・K염(MW=126.15)/H2O 10ml]
B. K-인산염 완충액, pH 5.90.15M
C. 4-아미노안티피린 용액0.15%(4-아미노안티피린 150mg/H2O 100ml)
디. EHSPT(TOOS) 용액0.3%［EHSPT(N-에틸-N-(2-하이드록시-3-설포프로필)-m-톨루이딘) 300mg/H2 100mlO]
E. TPP 용액3mM[TPP(티아민 피로인산염) 13.8mg(MW=460.77)/H2O 10ml]
0.15mM[FAD 1.3mg・2Na 염(MW=865.55)/H2O 10ml]
15mM[EDTA 590mg・2Na 염(MW=394.22)/H2O 100ml]
H. MgSO4 용액0.15M［MgSO4 3.4g・7H2O(246.48)/H 100ml 2O]
I. 퍼옥시다제 용액50U/ml［퍼옥시다제 45mg(110푸르푸로갈린 단위/mg)/H2O 100ml]
J. 효소 희석제50mM K-인산 완충액, pH 5.7

절차

1.다음 작업 용액을 갈색 병에 준비하여 보관하세요. 얼음 위에.

10mlK-인산염 완충액, pH 5.9(B)
2ml4-아미노안티피린 용액(C)
2mlEHSPT 솔루션(D)
2mlTPP 솔루션n (E)
2mlFAD 용액(F)
2mlEDTA 용액(G)
2ml MgSO4 용액(H)
3ml과산화효소 (I)
분석 혼합물의 농도
피루브산48mM
K-인산염 완충액50mM
4-아미노안티피린0.48mM
EHSPT 0.58mM
TPP0.19mM
FAD0.01mM
EDTA0.97mM
MgSO49.7 mM
과산화효소약 4.8 U/ml

2.작업 용액 2.5ml를 피펫으로 옮깁니다. 큐벳(d=1.0cm)에 피루브산 용액(A) 0.5ml를 넣고 37°C에서 평형화시킨다. 5분 정도.

3.효소 용액 0.1ml*를 넣고 가볍게 뒤집어 섞으세요. p>

4.온도가 37℃인 분광 광도계에서 물에 대해 3~4분간 550nm에서 광학 밀도의 증가를 기록하고 ℃ #x394;곡선의 초기 선형 부분으로부터 분당 OD(ΔOD 테스트).
동시에, 동일한 방법을 사용하여 블랭크율(ΔOD 블랭크)을 측정합니다. 효소 용액 대신 효소 희석액을 첨가하는 것을 제외하고는 테스트하십시오.

*효소 제제를 얼음처럼 차가운 효소 희석제(J)에 녹인 다음, 동일한 버퍼로 0.1−0.5U/ml로 줄이고 얼음에 보관하세요.

계산

활동량은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다:

  • 활동량(U/ml) =< /p>

  • ΔOD/min (ΔOD 테스트−ΔOD 공백)×Vt×df< /p>

    36.88×1/2×1.0×Vs

  • = &# x394;OD/min×1.68×df

체중 활성도(U/mg) = (U/ml)×1/C

Vt : 총 용량(3.10ml)
Vs : 시료량(0.10ml)
36.88: 분석 조건에서 퀴논이민 염료의 밀리몰 흡광계수(cm2 /마이크로몰)
1/2 : H2 1몰이 O2는 0.5몰의 퀴논이민 염료를 생성합니다.
1.0 : 빛의 경로 길이(cm)
df : 희석 인자
C : 용해 시 효소 농도(c mg/ml)

참조

1) LPHager, DMGeller 및 F.Lipman; Fed.Proc., 13, 734(1954).

2) B.Sedewitz, KHSchleifer 및 F.Gotz; J.Bacteriol,160, 273(1984).

3) B.Sedewitz, KHSchleifer 및 F.Gotz; J.Bacteriol,160, 462(1984).

표 1. 피루베이트 산화효소의 기질 특이성

  • < /tr>
    기질(50mM)상대활성도(%)
    피루브산100
    α-케토부티레이트5.8
    α-케토글루타레이트0
    옥살로아세트산0
    DL-락테이트0
    < /li>
  • 기판(50mM) 상대활성도(%)
    아세트산0
    아세토아세트산0
    L-알라닌< /th>0
    L-아스파르트산염0

표 2. Effect of Various Chemicals on Pyruvate oxidase

[The enzyme dissolved in 50mM K-phosphate, pH 6.0 (10U/ml) was incubated with each chemical at 25Ȑ /p>

  • < td>97< tr>
    ChemicalConcn.(mM)Residual
    activity( %)
    None-100
    Metal salt2.0
    MgCl296
    CaCl293
    Ba(OAc)2
    FeCl38.4
    CoCl284
    MnCl276
    ZnSO448
    Cd(OAc)286
    NiCl2119
    CuSO< sub>40.9
    Pb(OAc)233
    AgNO3 0
    HgCl20
    PCMB1.066
    MIA2.0 96
  • ChemicalConcn.(mM) Residual
    activity(%)
    NaF2.0100
    NaN32094
    EDTA5.0107
    o-Phenanthroline 2.097
    α,α′-Dipyridyl1.0 95
    Borate50102
    IAA2.0102
    NEM2.0 104
    Hydroxylamin2.098
    Triton X-100 0.10%143
    Brij 350.10%133
    Tween 200.10%146
    Span 20< /td>0.10%121
    Na-cholate0.10%116
    SDS0.05%85
    DAC0.05%53

Ac, CH3CO; PCMB, p-Chloromercuribenzoate; MIA, Monoiodoacetate; EDTA, Ethylenediaminetetraacetate;
IAA, Iodoacetamide; NEM, N-Ethylmaleimide; SDS, Sodium dodecyl sulf chloride.

  • Fig.1. Stability (Power form )

    Fig.1. Stability (Power form)

    (kept under dry conditions)

  • Fig.2. pH-Activity

    그림 .2. pH-Activity

    (37℃ in 50mM K-phosphate buffer)

  • Fig.3. Temperature activity

    Fig.3. Temperature activity

    (in 50mM K-phosphate buffer, pH5.7)

  • Fig.4. pH-Stability

    Fig.4. pH-Stability

    25℃,20hr-treatment with 50mM buffer solution (contg. 10mM MgSO4. 10μM FAD, 0.2mM TPP):pH4.0-6.0, acetate;pH5.7-8.0 K-phosphate; pH7.5-9.0 ,Tris-HCI

  • Fig.5. Thermal stability

    Fig.5. Thermal stability

    15min-treatment with 50mM K-phosphate buffer(cong. 10mM MgSO4. 10& #x3BC;M FAD, 0.2mM TPP), pH6.0. enzyme concn.:10U/ml

활성 측정법(Japanese)

1. 원리

2. 정의

하기 조건으로 1분간에 1마이크로몰의 H2O2를 생성하는 효소량을 1단위(U)로 한다.

3. 시약

  • 0.3M 피루브산 수용액〔378mg의 피루브산·K염(MW=126.15)을 10ml의 증류수에 용해시킨다. ]
  • 0.15M 인산칼륨 완충액, pH 5.9
  • 0.15% 4-AA 수용액(150mg의 4-아미노안티피린을 100ml의 증류수에 용해한다.)< /li>
  • 0.3% EHSPT(TOOS) 수용액[300mg의 EHSPT를 100ml의 증류수에 용해]
  • 3.0mM TPP 수용액[13.8mg의 TPP(MW=460.77)를 10ml의 증류수에 용해한다. ]
  • 0.15mM FAD 수용액 [1.3mg의 FAD · 2Na 염 (MW = 865.55)을 10ml의 증류수에 용해시킨다. ]
  • 15mM EDTA 수용액 [590mg의 EDTA · 2Na 염 (MW = 394.22)을 100ml의 증류수에 용해시킨다. ]
  • 0.15M MgSO4 수용액 [3.4g의 MgSO4·7H2O(MW=246.48)를 100ml의 증류수에 용해시킨다. ]
  • 50U/ml POD 수용액 [45 mg 퍼옥시다제 (POD)(110 풀프로갈린 단위/mg)를 100 ml 증류수에 용해시킨다. ]

효소 용액: 효소 표품을 미리 빙냉한 50mM K-인산 완충액, pH 5.7로 용해하고, 분석 직전에 같은 완충액으로 0.1-0.5U/ml로 희석한다.

4. 절차

1. 아래 반응 혼합물을 준비 한다(갈색병에서 빙냉 보존).

< td class="w20p">(B)< td>TPP 수용액
10mlK-인산 완충액
2ml4-AA 수용액(C)
2mlEHSPT 수용액(D)
2ml(E)
2mlFAD 수용액(F)
2mlEDTA 수용액(G)
2mlMgSO4수용액(H)
3mlPOD 수용액(I)

2. 반응 혼합물 2.5ml를 큐벳(d = 1.0cm)로 채취하고, 피루브산 수용액 (A) 0.5ml를 첨가하고, 약 5 분간 예비 가온한다.

3. 효소 용액 0.1ml를 첨가하고 완만하게 혼합한 후, 물을 대조군으로 37℃로 제어된 분광광도계 550nm의 흡광도 변화를 3~4분간 기록하고, 그 초기 직선 부분으로부터 1분간 당의 흡광도 변화를 구한다(ΔODtest).

4. 맹검은 반응 혼합액으로 효소 용액 대신 효소 희석액 (50 mM K-인산 완충액, pH 5 .7)을 0.1ml 첨가하고, 상기와 같이 조작하여 1 분당 흡광도 변화를 구한다 (ΔODblank).

5. 수식

  • U/ml=

  • ΔOD/min (ΔOD test−ΔOD blank)×3.1(ml)× 희석 배율

    36.88×1/2×1.0×0.1(ml)

=ΔOD/min×1.68×희석 배율
U/mg= U/ml×1/C
36.88: Quinoneimine 염료의 상기 측정 조건 하에서의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm2< /sup>/micromole)
1/2: 효소 반응에서 생성된 H2O2 의 1분자로부터 형성하는 Quinoneimine 색소는 1/2분자인 것에 의한 계수.
1.0: 광로 길이(cm)
C : 용해시 효소 농도 (c mg/ml)

문의하기

생명과학 연구용 시약에 관한 궁금하신 점을 문의해주세요.
빠른 시일 내에 답변드리겠습니다.