TOYOBO BIO

진단시약원료 효소

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준비 및 사양

< tbody>< tr>

성상	연한 갈색 무정형 분말, 동결건조
활동량	GradeⅢ 3.0 U/mg-solid 이상
오염물질	NADPH 산화효소	≤1.0×10^-1%
안정제	설탕

< /div>

속성

< td>60−65℃ (그림 3)< th align="left">다양한 화학물질의 효과

최적 온도
안정성	−20℃
분자량에서 안정적	약. 600,000(겔 여과 기준)
미카엘리스 상수	1.85×10^-5M ((프로토카테츄에이트 )
구조	비헴 이온이 있는 단백질
억제제	Ag⁺, Hg⁺⁺
최적 pH< /th>	9.0 (그림 2)
pH 안정성	pH 6.0−9.5(25℃, 72시간) (그림 4)
열 안정성	55 이하(pH 7.5, 1시간) (그림 5)
(표 1)

응용 프로그램

이 효소는 p-와 결합 시 콜린 에스테라제의 효소적 측정에 유용합니다. 하이드록시벤조에이트 하이드록실라제(HBH-311).

분석

원칙

프로토카테츄에이트의 소멸은 분광 광도법으로 290nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 하나의 단위는 분당 1마이크로몰의 프로토카테츄에이트를 산화시킵니다.

방법

h2>

시약

A. 트리스-아세테이트 완충액, pH 7.5	50mM［트리스(MW=121.14) 6.1g을 약 800ml의 H2O에 녹이고, 25℃에서 pH를 7.5로 조정한 후 x2103; 0.2M 아세트산으로 1,000ml까지 H₂O.]
B로 채웁니다. 프로토카테츄에이트산용액	0.4mM［완충액(A) 약 80ml에 프로토카테츄에이트 6.16mg을 녹이고, 25℃에서 pH를 7.5로 조정한 후; 1.0N KOH로 완충액(A)을 100ml까지 채웁니다.]( 신선하게 준비해야 함)

절차

1.프로토카테츄에이트 용액 3.0ml를 피펫으로 옮깁니다. (B) 큐벳(d=1.0cm)에 넣고 37°C에서 평형화합니다. 약 5분 동안.

분석 혼합물의 농도
트리스-아세테이트 버퍼	50mM
프로토카테츄에이트	0.39mM

2.효소 용액* 0.05ml를 첨가하고 가볍게 뒤집어 섞습니다.

3.온도가 37℃인 분광 광도계에서 물에 대한 290nm에서의 광학 밀도 감소를 3~4분간 기록하고 계산합니다. 곡선의 초기 선형 부분에서 분당 OD(OD 테스트).
동시에 동일한 방법을 사용하여 공백률(OD 공백)을 측정합니다. 효소용액 대신 효소희석제(A)를 첨가하는 것을 제외하고는 시험으로 한다.

^*효소를 녹인다 얼음처럼 차가운 희석제(A)(1.0mg/ml 이상)에 준비하고 분석 직전에 동일한 완충액으로 0.2−0.8U/ml로 희석합니다.

계산

활동은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다:

볼륨 활동(U/ml) =
ΔOD/분( ΔOD 테스트−ΔOD 공백)×Vt×df
3.8×1.0×Vs
= ΔOD/min×16.1×df

체중 활동(U/mg ) = (U/ml)×1/C

Vt	: 총 부피(3.05 ml)
Vs	: 샘플량(0.05ml)
3.8	: 프로토카테츄에이트의 밀리몰 흡광계수(cm²/마이크로몰)
1.0	: 빛의 경로 길이(cm )
df	: 희석 인자
C	: 효소 용해 농도(c mg/ml)

참조

1) H.Fujisawa 및 O.Hayashi; J.Biol.Chem., 243, 2673 (1968)

표 1. 프로토카테츄에이트 3,4-디옥시게나제에 대한 다양한 화학물질의 영향

[50mM Tris-Acetate 완충액(5U/ml)에 용해된 효소를 30℃에서 각 화학물질과 함께 배양했습니다. 1시간 동안.]

< tr>< /tr>
화학물질 농도(mM) 잔류
활동(%)
없음 - 100
금속염 1.0
AgNO₃ 26
BaCl₂ 97
CaCl₂ 97
CoCl₂ 97
CuSO₄ 95
FeSO₄ 79
MgSO₄ < /td> 100
MnCl₂ 100
NiCl₂ 100
ZnCl₂ 95
< /tr>< td>98
화학 th> 농도(mM) 잔류
활성도(%)
NaF 1.0 100
NaN₃ 1.0 98
EDTA 5.0
붕산염 50 97
SDS< /td> 0.05% 101
브리지 35 0.10% 103< /td>
트윈 20 0.10% 100
나콜레이트< /td> 0.10% 101

화학물질	농도(mM)	잔류 활동(%)
없음	-	100
금속염	1.0
AgNO₃		26
BaCl₂		97
CaCl₂		97
CoCl₂		97
CuSO₄		95
FeSO₄		79
MgSO₄	< /td>	100
MnCl₂		100
NiCl₂		100
ZnCl₂		95

화학 th>	농도(mM)	잔류 활성도(%)
NaF	1.0	100
NaN₃	1.0	98
EDTA	5.0
붕산염	50	97
SDS< /td>	0.05%	101
브리지 35	0.10%	103< /td>
트윈 20	0.10%	100
나콜레이트< /td>	0.10%	101

EDTA, 에틸렌디아민테트라아세테이트; SDS, 도데실황산나트륨.

그림 1. 안정성(분말 형태)
(건조한 조건에서 보관)
그림 2. pH-활성
(50mM 트리스-아세테이트 완충액 중 37℃)
그림 3. 온도 활동
(50mM K-인산염 완충액, pH 7.5)
그림 4. pH-안정성
25℃, 50mM 완충액으로 72시간 처리: pH 4-5.5, 아세트산; pH5.5-7.5 K-인산염, pH7.0-9.5 트리스-아세테이트; 효소 농도: 5U/ml
< /p>
그림 5. 열 안정성
50mM Tris-acetate 완충액(pH 7.5)으로 1시간 처리. 효소 농도: 5U/ml

活性測결정법(일본어)< /h2>
1. 원본
프로트카테큐의 속도 を290nm의 광도화에 의해 결정됩니다.
2. 정의
下記条件下記条件下記条件下記条件下記条件下記条件下記条件下記条件下記条件下記条件下記条件下記単位(U) to suru.
3.試薬
50mM Tris-酢酸緩衝液, pH7.5[6.1gの트리스 (MW=121.14)を約800mlの蒸留水下解し, 0.2M酢酸еpH7.5(25℃)に調整後,蒸留水로 1,000ml입니다}
0.4mM프로트카테큐酸溶液〔6.16mgの프로트카테큐酸を緩衝液(A)데溶解し,1N KOH下pH7.5 (25℃)に調整後,緩衝液(A)下100mlとはしょ(용시계製)
酵素溶液：酵素標品標品酵素予め氷冷氷冷した緩衝液緩衝液 a で溶解 (1.0mg/ml 以上以上) しししししししに同緩衝液ででで 0.2〜0.8u/ml に希釈する。

4. 절차
1. 기질 용액(B) 3.0ml를 큐벳(d=1.0cm)에 채취하고, 37℃로 약 5분 예비 가온한다.
2. 효소 용액 0.05ml를 첨가하고 완만하게 혼합한 후, 물을 대조군으로 37℃로 제어된 분광 광도계 에서 290nm의 흡광도 변화를 3~4분간 기록하고, 그 초기 직선 부분으로부터 1분간당의 흡광도 변화를 구한다(ΔOD test).

3. 맹검은 기질 용액(B)에, 효소 용액 대신에 효소 희석액(A)을 0.05ml 첨가하고, 상기와 동일 를 조작하여 분당 흡광도 변화를 구한다(ΔOD blank).
5. 수식
U/ml=
ΔOD/min (ΔOD test−ΔOD blank)×3.05(ml)× 희석 배율
3.8×1.0×0.05(ml)
= ΔOD/min×16.1×희석 배율
U/mg = U/ml× 1/C
3.8 : 프로토카테큐산의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm²/micromole)
1.0 : 광로 길이(cm)
C : 용해시의 효소 농도 (c mg/ml)

	= ΔOD/min×16.1×희석 배율
U/mg	= U/ml× 1/C
3.8	: 프로토카테큐산의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm²/micromole)
1.0	: 광로 길이(cm)
C	: 용해시의 효소 농도 (c mg/ml)