TOYOBO BIO

진단시약원료 효소

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준비 및 사양

< tbody>

성상	백색 무정형 분말, 동결건조
활동	1등급 5.0U/mg-solid 이상
오염물질	류신 아미노펩티다제	≤1.0×10^-1%
오염물질	트립신 유사 활성	≤1.0×10^-1%

속성

< tbody>< th align="left">열 안정성 < td>Y-Pro(Ala)-X(Y, 펩타이드 또는 N-보호된 아미노산; X, 아미노산,
펩타이드, 아미드 또는 에스테르)(표 1)

기질 특이성
안정성	−20℃에서 안정적 최소 1년 동안 (그림 1)
분자량	대략. 78,000
등전점	9.1
미카엘리스 상수	2.5×10^-5M(Z-Gly-Pro-MCA)
미카엘리스 상수	1.4 ×10^-4M(Z-Gly-Pro-2NNap)
구조	모노머< /td>
억제제	DFP, 3, 4-디클로로이소쿠마린, Z-Gly-Pro-CH₂Cl
최적 pH	6.5 (그림 2)
최적 온도	37℃ (40℃) ²⁾ (그림 3)
pH 안정성	5.5−8.5(30℃,15시간)(그림 4)
40℃ 미만 (pH7.0,10min) (그림 5)
다양한 화학물질의 영향	(표 2)

< /div>

응용 프로그램

이 효소는 펩타이드의 아미노산 서열을 결정하는 데 유용합니다. 및 프롤린 잔기를 함유한 단백질.

분석

원칙

Principle

p-니트로아닐린의 외관은 분광광도법으로 410nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 하나의 단위는 분당 1마이크로몰의 p-니트로아닐린을 형성합니다.

방법

시약

A. K-인산염 완충액, pH 7.0	0.1M
B. Z-Gly-Pro-pNA 용액	5mM［21.3mg의 Z-Gly-Pro-pNA(MW=426.43)를 약 8ml의 40% 디옥산에 60°C의 뜨거운 욕조에 녹입니다. 25°C로 식힌 후 40% 디옥산을 10ml까지 채웁니다](신선하게 준비해야 함)
C. 아세트산 완충액, pH 4.0	10% TritonX-100을 함유한 1M 용액(5℃에 보관)
D. 효소 희석제	50mM K-인산 완충액, pH 7.0

절차

1.시험관에 다음 반응 혼합물을 준비하고, 30℃에서 평형을 이루다 약 5분 동안.

< /table>

1.0ml	K-인산염 완충액	(A)
0.25ml	기질 용액	(B)

2.효소 용액* 0.1ml를 넣고 가볍게 뒤집어 섞습니다.

3.30°에서 정확히 5분 후 2.0ml의 아세테이트 버퍼(C)를 추가하여 반응을 중지하고 410nm에서 광학 밀도를 측정합니다. 물에 대한 OD 시험(OD 시험).
동시에 30℃에서 5분 동안 배양한 후 반응 혼합물을 아세트산 완충액(C) 2.0ml와 먼저 혼합한 후 효소를 첨가하여 바탕을 준비합니다. 용액(OD 블랭크).

^*분석 직전에 효소 제제를 얼음처럼 차가운 효소 희석제(D)에 녹이고 0.05−로 희석합니다. 동일한 버퍼로 0.2U/ml.

계산

활동을 계산할 수 있습니다. 다음 공식을 사용합니다:

부피 활동(U/ml) =
ΔOD(OD 테스트−OD 공백)×Vt×df
5.57×1.0 ×t×Vs
= ΔOD×1.20×df

체중활동량(U/mg) = (U/ml)×1/C

분석 혼합물의 농도
인산염 완충액	77.8 mM
Z-Gly-Pro-pNA	0.926mM

< /tr>

Vt	: 총 용량(3.35ml)
Vs	: 샘플 용량(0.1ml)
5.57	: 분석 조건에서 p-니트로아닐린의 밀리몰 흡광 계수(cm²/micromole)
1.0	: 광선 길이(cm)
t	: 반응 시간(5분)
df	: 희석 인자
C	: 효소 농도 용해 상태(c mg/ml)

참고자료< /h2>
1)T.Yoshimoto 및 D.Tsuru; Agric.Biol.Chem., 42, 2417 (1978)
2)T.Yoshimoto, R.Walter 및 D.Tsuru; J.Biol.Chem., 255, 4786(1980)
3)R.Walter; Biochim.Biophys.Acta.,422, 132(1976)
4)T.Yoshimoto, RCOlowski 및 R.Walter; Biochem.J., 16, 2942(1977)
5)T.Yoshimoto, M.Fischl, RCOlowski 및 R.Walter; J.Biol.Chem., 253, 3708 (1978)
6)T.Yoshimoto 및 D.Tsuru; 단백질, 핵산 및 효소(일본어), 29, 127(1984)
7)L.Haeffiner-Gormley, L.Parente 및 DBWetlaufer; Int.J.Peptide Protein Res., 26, 83 (1985)
8)T.Yoshimoto, K.Kawahara, F.Matsubara, K .Kado 및 D.Tsuru; J.Biochem., 98, 975 (1985)

표 1. 프롤린 특이적 엔도펩티다제의 기질 특이성

< td>< td>< tr>

기판	Km (mM)	kcat (s^-1)	kcat/Km (mM^-1・S^-1)
↓
Pro-2NNap	가수분해되지 않음
Z-Pro-2NNap		가수분해되지 않음
Gly-Pro-2NNap		가수분해되지 않음
Z-Gly-Pro-MCA	0.025	115	4600
Z-Gly-Pro-2NNap	0.14	169	1212
Z-Gly-Pro-pNP	0.125	102	816
Z-Ala-Pro-2NNap	0.08	642	834
ZD- Pro- 2NNap	0.20	0.142	0.73
알라-
Z-Ala-Gly-Pro-2NNap	0.29	192	664
ZD-Ala-Gly-Pro-2NNap	0.14	38	271
Z-Gly-Pro-Leu	0.22	23	104
Z-Gly-Pro-Phe	0.74	180	250
Z-Gly-Pro-ALa	0.39	240	620
Z-Gly-Pro-D-Ala		가수분해되지 않음
Z-Gly-Pro-Leu-Gly	0.32	520	1600
Z- Gly-Pro-Leu-Ala	0.42	520	1100
Z-Gly-Pro -Leu-D-Ala	1.5	1600	1070
Z-Gly-Pro- Leu-Gly-Gly	1.4	700	500
Z-Gly-Pro-Leu -Gly-Ala	1.82	1000	550

Z, 카보벤족시; MCA, 4-메틸-쿠마릴-7-아미드; 2NNap, β-나프틸아미드; pNP, p-니트로페닐 에스테르.

표 2. Effect of Various Chemicals on Proline specific endopeptidase

[The enzyme dissolved in 50mM K-phosphate buffer, pH 7.0 (2.5U/ml) was incubated with each chemical at 23&# 30min.]

Chemical	Concn.(mM)	Residual< br>activity(%)
None	-	100
Metal salt	2.0
MgCl₂		72.1
CaCl₂		74.6
BaCl₂		74.3
FeCl₃		52.6
CoCl₂		62.7
MnCl_{2< /sub>}		68.9
ZnSO₄		56.8
Cd(OAc)₂		31.9
NiCl₂		66.8
CuSO ₄		45.2
Pb(OAc)₂< /td>		59.8
AgNO₃		55.7
HgCl₂		0
PCMB	2.0	71.9
MIA	2.0	78.1

< td>77.3

Chemical	Concn.(mM )	Residual activity(%)
NaF	2.0	76.9
NaN₃	20.0
DFP	1.0	2.7
o- Phenanthroline	2.0	84.9
α,α′-Dipyridyl	1.0	84.9
Borate	50	73.4
IAA	2.0	62.8
NEM	2.0	74.4
Hydroxylamine	2.0	77.4
3,4 -Dichloroiso-
coumarin	2.0	9.0
Triton X-100	0.10%	86.4
Brij 35< /td>	0.10%	84.8
Tween 20	0.10%	84.1< /td>
Span 20	0.10%	81.9
Na-cholate< /td>	0.10%	84.1
SDS	0.05%	73.0

Ac, CH3CO; PCMB, p-Chloromercuribenzoate; MIA, Monoiodoacetate; DFP , Diisopropylphosphorofluoridate; IAA, Iodoacetamide; NEM, N-Ethylmaleimide; SDS, Sodium dodecyl sulfate.

Fig.1. Stability (Powder form)
(kept under dry conditions)
Fig.2. pH-Activity
(30℃ in 50mM phosphate buffer)
>
Fig.3. Temperature activity
(in 50mM phosphate buffer, pH 7.0)
Fig.4. pH-Stability< /p>
30℃, 15hr-treatment with buffer solution: pH4.5-7.0, 50mM acetate;pH6.0-8.5, 0.1M phosphate

Fig.5. Thermal stability

10min-treatment with 0.1M phosphate buffer, pH7.0 enzyme concn.:5U/ml

< /div>

활성 측정법(Japanese)

1. 원리

p-Nitroaniline 생성량을 410nm에서의 흡광도 변화로 측정 .

2. 정의

하기 조건으로 1분간에 1마이크로몰의 p-Nitroaniline을 생성하는 효소량을 1단위(U )로 한다.

3. 시약

0.1M K-Phosphate 완충액, pH7.0
5mM Z-Gly-Pro-pNA 용액 [21.3mg의 Z-GlyPro-pNA (MW = 426.43)을 60 ℓ의 욕조에서 약 8ml의 40 % 디 옥산 증류수에 용해시킨다. 본 용해액을 25℃까지 냉각한 후, 40% 디옥산으로 10ml로 한다](용시 조제)
10% 트리톤 X-100을 포함하는 1M 아세트산 완충액, pH4.0< /li>
효소 희석액[50mM K-Phosphate 완충액, pH7.0]

효소 용액: 효소 표품을 미리 빙냉한 효소 희석 용액 (D)에 용해시키고 분석 직전에 동일한 완충액으로 0.05-0.2U / ml로 희석한다.

4. 절차

1. 시험관에 하기 반응 혼합물을 제조하고, 30℃ ;로 약 5분간 예비가온한다.

< td class="w20p">(A)< /tr>

1.0 ml	K-Phosphate 완충액
0.25ml	기질 용액	(B)

2. 효소 용액 0.1ml를 첨가하여 반응을 개시한다.

3.30℃에서 정확하게 5분간 반응시킨 후, 아세트산완충액(C) 2.0ml를 첨가하여 반응을 정지 하자. 이 용액에 대해 410 nm에서의 흡광도를 측정한다 (ODtest).

4.맹검은 반응혼액①을 30℃으로 5분간 가온 후, 아세트산완충액(C)2.0 ㎖를 첨가하여 혼화시킨 후, 효소 용액 0.1㎖를 가하여 조제한다. 이 액에 대하여 이하 상기와 같이 흡광도를 측정한다(ODblank).

5. 수식

U/ml=
ΔOD(OD test-OD blank)×3.35(ml)×희석 배율
< p class="txt_14">5.57×1.0×5(분)×0.1

	= Δ OD×1.20×희석 배율
U/mg	= U/ml×1/C
5.57	: p-Nitroaniline의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm²/micromole)
1.0	: 광로 길이(cm)
C	: 용해 시 효소 농도(c mg/ml)< /td>

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