진단시약원료 효소

준비 및 사양

< tbody>
성상백색 무정형 분말, 동결건조
활동GradeⅢ 5.0U/mg-solid 이상
오염물질젖산염 탈수소효소≤1.0×10-3%
피루브산 키나제≤0.05%
안정제BSA, 당 알코올

속성

th>< td>40℃ 미만 (pH 7.0, 15분) (그림 5)
안정성 안정적 −20℃ 최소 1년 동안 (그림 1)
분자량 대략. 390,000(겔 여과 기준)
등전점 6.0±0.1
구조 효소 분자당 4개의 하위 단위(MW100,000)
미카엘리스 상수
1.9×10-4M(포스포에놀피루베이트)
최적 pH 7.5 −8.0 (그림 2)
최적 온도 60℃ ; (그림 3)
pH 안정성 pH 5.0−8.0 ( 25℃, 24시간) (그림 4)
열 안정성

응용 프로그램

이 효소는 말산염과 결합하여 이산화탄소를 효소적으로 측정하는 데 유용합니다. 임상 분석에서의 탈수소효소(MAD-211).

ASSAY

원칙

Principle

NADH의 소멸은 분광광도법으로 340nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 1개 단위는 분당 1마이크로몰의 NADH를 산화시킵니다.

방법

시약

< /tr>
아. 완충액0.1M Tris-HCl 완충액, pH 8.0
B. Na2CO3 용액0.1M［Na22CO3(MW=105.99)/100ml의 H2O]
C. K-포스포에놀피루베이트 용액32mM[PEP 33.0mg・K(MW=206.1)/H2O5ml 용해](신선하게 준비해야 함)
디. MgSO4 용액1M［MgSO4・7H2O(MW=246.48)/20 4.93g을 용해합니다. ml의 H2O]
E. NADH 용액1.4mM[NADH 5.34mg 용해・3H2O(MW=763)/H2O 5ml]
F. MDH 용액약 100U/ml[말산염탈수소효소(TOYOBO GradeII)를 20mM Tris-HCl 완충액, pH 8.0으로 약 100U/ml로 용해](신선하게 준비해야 함)
G. 효소 희석제20mM K-인산 완충액, pH 7.0

절차

1.큐벳에 다음 반응 혼합물을 준비합니다(d= 1.0cm) 30℃에서 평형을 이룹니다. 약 5분간 담가주세요.

1.77ml버퍼 용액(A)
0.3mlNa2CO3 용액< /td>(B)
0.3mlK-포스포에놀피루베이트 용액(C)
0.03mlMgSO4 용액(D)
0.3mlNADH 용액(E)
0.3mlMDH 용액< /td>(F)
< th class="w20p" colspan="2">분석 혼합물의 농도
K-포스포에놀피루베이트 3.1mM
트리스-HCl57mM
Na2CO39.7mM
MgSO49.7mM
NADH0.14mM
MDH9.7 U/ml
K-인산염0.65mM

2.0.1ml의 효소 용액*을 추가하고 가볍게 뒤집어서 혼합합니다.

3.물에 대한 340nm에서 광학 밀도 감소를 기록합니다. 30°로 온도 조절된 분광 광도계에서 3~4분 동안 측정하고 곡선의 초기 라이너 부분에서 분당 OD를 계산합니다(OD 테스트).
동시에 효소용액 대신 효소희석액(G)을 첨가하는 것을 제외하고는 시험과 동일한 방법으로 바탕율(ΔOD 공백)을 측정한다.

*효소 제제를 얼음처럼 차가운 효소 희석제(G)에 녹이고 동일한 완충액으로 0.2−0.7U/ml로 희석하여 보관합니다. ice.

계산

활동은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다.< /p>

  • 볼륨 활동(U/ml) =

  • ΔOD/min (ΔOD 테스트−ΔOD 공백)×Vt×df

    6.22×1.0×Vs

  • = ΔOD/min×4.98×df

    • < /ul>

    체중활동량(U/mg) = (U/ml)×1/C

    Vt: 총 용량(3.1ml)
    Vs: 샘플 용량( 0.1ml)
    6.22: NADH의 밀리몰 흡광계수(cm2/마이크로몰)< /td>
    1.0: 광선 길이(cm)
    df: 희석 인자
    C: 용해 시 효소 농도(c mg/ml )

참조

1) W.Wilson, P.Jesyk, R.Rand 및 RDBevill; Clin.Chem.,19, 640(1973)

2) RLForrester, LJWataji, DASilverman 및 KJPierre; Clin.Chem.,22, 243(1976)

표 1. Effect of Various Chemicals on Phosphoenolpyruvate carboxylase

[The enzyme solution dissolved in 20mM K-phosphate buffer, pH 7.0 (20U/ml) was incubated with each chemical

  • ChemicalConcn.(mM)Residual
    activity (%)
    None-100
    Metal salt2.0
    MgCl2105
    CaCl2105
    Ba(OAc)2 103
    FeCl392
    CoCl2106
    MnCl2< /sub>107
    ZnSO4103
    Cd(OAc)2104
    NiCl20
    CuSO 40
    Pb(OAc)2< /td>105
    AgNO30
    HgCl20
    MIA2.060
    2-Mercaptoethanol2.0 101
  • < /tr>
    ChemicalConcn. (mM)Residual
    activity(%)
    PCMB 0.180
    NEM2.087
    IAA2.090
    Hydroxylamine 2.095
    EDTA5.0100
    o-Phenanthroline2.0103
    α,α′-Dipyridyl 2.0109
    Borate5.0103
    NaF2.0106
    NaN32.0106
    Triton X-1000.10%111
    Brij 350.10%110
    Tween 200.10%112
    Span 200.10%109
    Na-cholate0.10%108
    SDS 0.05%1
    DAC0.05%99

Ac, CH3CO; PCMB, p-Chloromercuribenzoate; MIA, Monoiodoacetate; EDTA, Ethylenediaminetetraacetate; IAA, Iodoacetamide; NEM, N-Ethylmaleimide; SDS, Sodium dodecyl sulfate; DAC, Dimethylbenzylallkylammonium chloride.

    ">Fig.1. Stability (Powder form)

    Fig.1. Stability (Powder form)

    (kept under dry conditions)

  • Fig.2. pH-Activity

    Fig.2. pH-Activity

    30℃, in 50mM buffer solution: pH6.0-8.5, MES: pH7.5-9.0, Tris-HCI

  • Fig.3. Temperature activity

    Fig.3. Temperature activity

    (in 20mM K-phosphate buffer,pH7.0)

  • Fig .4. pH-Stability

    Fig.4. pH-Stability

    25℃,24hr-treatment with 50mM buffer solution contg. 10mM MgSO4: pH3.0-5.0, Acetate;pH5.0-8.0, K-phosphate; pH8.0-9.0, Tris-HCI

    • < li>

    Fig.5. Thermal stability

    Fig.5. Thermal stability

    15min-treatment with 20mM K-phosphate buffer,pH7.0 enzyme concn.: 2.0U/ml

활성 측정법(Japanese)

1. 원리

2. 정의

하기 조건으로 1분간에 1마이크로몰의 NADH를 산화하는 효소량을 1단위(U)로 한다.

3. 시약

  • 0.1M Tris-HCl 완충액,pH8.0
  • 0.1 M Na 2CO3 수용액(1.06g의 무수 탄산나트륨(MW=105.99)을 증류수 100ml에 용해한다.)
  • 32.0mM K-Phosphoenolpyruvate 수용액(33.0mg의 K-phosphoenolpyruvate(MW=206.1)을 증류수 5.0ml에 용해한다.)(용시 조제)
  • 1.0M MgSO4 수용액 (4.93g의 MgSO4·7H2O(MW=246.48)를 증류수 20ml에 용해한다.)
  • 1.4mM NADH 수용액( 5.34 mg의 NADH · Na 2 (MW = 763)를 증류수 5.0 ml에 용해시킨다. 20 mM TrisHCl pH 8.0으로 제조 된 Grade II)를 용해시킨다. 산 완충액, pH 7.0에서 용해시키고, 동일한 완충액으로 0.2 & # x301C; 0.7U / ml로 희석한다.

    4. 절차

    1. 하기 반응 혼합물을 큐벳(d=1.0cm)으로 제조 30 ~ 약 5 분간 예비 가온한다.

    < td class="w10p">(A)
    1.77Tris-HCl 완충액
    0.30Na2CO3 수용액 (B)
    0.30K-Phosphoenolpyruvate 수용액 (C)
    0.03MgSO4 수용액 (D)
    0.30NADH 수용액(E)
    0.30Malate dehydrogenase 용액(F)

    2.효소 용액 0.1ml를 첨가하고, 완만하게 혼화 후, 물을 대조군으로 30℃으로 제어된 분광 광도계로 340nm의 흡광도 변화를 3〜4분간 기록하고, 그 초기 직선 부분으로부터 1분간당의 흡광도 변화를 구한다(& #x394;ODtest).

    3. 맹검은 효소 용액 대신에 효소 희석액을 0.1ml 첨가하고, 상기와 같이 조작을 실시하여 1분간 당 흡광도 변화를 구한다(ΔODblank).

    5. 수식

    • U/ml=

    • ΔOD/min (ΔOD test−ΔOD blank)×3.1(ml)× 희석 배율

      6.22×1.0×0.1(ml)

    < /tr>
    = ΔOD/min×4.984×희석 배율
    U/mg= U/ml× 1/C
    6.22: NADH의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm2/micromole)
    1.0: 광로 길이(cm)
    C: 용해 시 효소 농도 (c mg/ml)

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