TOYOBO BIO

진단시약원료 효소

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PEROXIDASE

준비 및 사양

PEO-301/302는 다음에서 격리됩니다. 우리만의 방법으로 고추냉이 뿌리를 만듭니다. PEO-131은 Paul 등의 수정된 방법에 따라 SP Sephadex C-50을 사용하여 다른 동종효소로부터 크로마토그래피로 분리됩니다.¹⁾ 동일한 RZ 값(ca.3.3)을 갖는 퍼옥시다제 분획이 결합되어 생성됩니다. 준비. 이 제제는 RZ 값이 ca.3.3이고 전기영동적으로 균질합니다. 반면 GradeIII는 부분적으로 정제된 준비입니다.

외관	적갈색 무정형 분말, 동결건조
활동	GradeⅠ 250 푸르푸로갈린 U/mg-고체 이상 (-131) (RZ ≥ 3.0, 무염) GradeⅢ 110 푸르푸로갈린 U/mg-고체 이상 (-301) (RZ ≥ 2.0, 안정제 약 30% 함유) GradeⅢ 180 퍼푸로갈린 U/mg-고체 이상 (-302) (RZ ≥ 2.0, 무염)
오염물질	포스파타제 ≤1.0×10-3%(GradeIII)

속성

< td>50℃ 미만 (pH 6.0, 10분) (그림 9)

열 안정성
안정성	−20℃에서 안정적 최소 1년 동안 (그림 1,2,3)
분자량	약. 40,000
구조	1몰의 프로토헤민IX를 포함한 당단백질 ²⁾
억제제	시안화물, 황화물, 불화물, 아지화물 ³）
최적 pH	6.0−7.0 (그림 6)
최적 온도	45℃ (그림 7)
pH 안정성	pH 5.0−10.0 ( 25℃, 20시간) (그림 8)
다양한 화학물질의 영향	(표 1)

< h2 class="ttl_bigLine">응용 4〜11)

이 효소는 H_{의 효소적 측정에 유용합니다. 2}O₂ 임상 분석. 특히, 고도로 정제된 제제(Grade I)는 조직화학 및 세포화학의 단백질 추적자로서 유용하며 동물학적 신경학의 귀중한 실험 도구로 유용합니다. 또한, 효소 제제는 효소 면역 분석에서 효소 표지로 사용되어 왔습니다. Grade III(-302)은 건식화학에 적합합니다. 반면, 효소는 폐수에서 페홀을 줄이는 데 기여합니다.

분석

원칙

Principle

Purpurogallin의 외관은 분광 광도법으로 420nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 하나의 퍼푸로갈린 단위는 20초 안에 1mg의 퍼푸로갈린을 형성합니다.

방법

시약

A. 피로갈롤 용액	5%(W/V)(신선하게 준비해야 함).
B. H₂O₂ 용액	0.147M［30%(W/V) H₂O 1.67ml 희석 ₂ ~ 100ml H₂O] 포함(신선하게 준비해야 함)
C. 인산염 완충액, pH6.0	0.1M
D. H₂SO₄ 솔루션	2.0N

절차

1. 시험관(32×200mm)에 다음 반응 혼합물을 준비하고 20×2103;에서 평형화합니다. 약 5분 동안.

14.0ml	H₂O
2.0ml	파이로갈롤 용액	(A)
1.0ml	H₂O₂ 용액	(B)
2.0ml	인산염 완충액, pH6.0	(C)

< tbody>

분석 혼합물의 농도
인산염 완충액	15 mM
파이로갈롤	40mM
H₂O₂	7.4mM

< /div>

2.효소액* 1.0ml를 넣고 섞어주세요.

3.20°에서 정확히 20초 후에 2.0N H₂SO₄ 용액(D) 1.0ml를 추가하여 반응을 중지합니다. p>

4.위에서 정지된 반응 혼합물에서 생성된 퍼푸로갈린을 에테르 15ml로 5회에 걸쳐 추출하고 결합된 에테르 추출물을 신선한 물로 100ml로 채웁니다. 에테르.

5.물에 대해 420nm에서 광학 밀도를 측정합니다(OD 테스트).
동시에 블랭크를 다음과 같이 준비합니다. 먼저 반응 혼합물을 20°C에서 20초 동안 배양한 후 2.0N H2SO4 용액(D) 1.0ml와 혼합한 다음 효소 용액을 넣고 시험과 동일한 방법으로 에테르로 추출합니다(OD 공백).

*효소 제제를 얼음처럼 차가운 0.1M 인산염에 녹입니다. 완충액, pH 6.0(C), 동일한 완충액을 사용하여 3.0−6.0 pur purogallin U/ml로 희석하고 얼음 위에 보관합니다.

계산

활동^**은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다:

볼륨 활동(U/ml) =
ΔOD(OD 테스트−OD 공백)×df
0.117×Vs
= ΔOD×8.547×df

체중 활성도(U/mg) = (U/ml)×1/C

Vs	: 샘플량(1.0ml)
0.117	: 에테르 내 퍼푸로갈린 1mg%에 해당하는 420 nm에서의 광학 밀도.
df	: 희석 인자
C	: 용해 시 효소 농도(c mg/ml)
^{* *}1 퍼푸로갈린 단위는 25℃에서 o-dianisidine으로 측정한 13.5 국제 단위와 같습니다.

< div class="b30">

참조

1)KGPaul 및 T.Stigbrand; Acta Chem.Scand., 24, 3607(1970).

2)LMShannon et al. ; J.Biol.Chem., 241, 2166(1966).

3)E.Kay et al. ; J.Biol.Chem., 242, 2470(1967).

4)R.Lasek et al. ; Brain Res., 8, 319(1968).

5)WMCowan 외. ; Brain Res , 37, 21(1972).

6)JHLa Vail et al. ; Brain Res., 58, 470(1973).

7)AMGraybiel 및 M.Devor; Brain Res., 68, 167(1974).

8)AHBunt 외. ; Brain Res., 102, 152(1976).

9)DRColman et al. ; Brain Res., 102, 156(1976).

10)M.Dubois-Dalcq et al. ; J.Histochem.Cytochem., 25, 1201(1977).

11)M.Sato et al. ; Brain Res., 140, 149(1978).

표 1. Effect of Various Chemicals on Peroxidase

[The enzyme dissolved in 0.1M phosphate buffer, pH 6.0 (50U/ml) was incubated with each chemical at 25℃ for 1 /p>

Chemical	Concn.(mM)	^{※Residual activity(%)}
None	-	100
Metal salt	2.0
MgCl₂		102
CaCl₂		102
Ba(OAc)₂		105
FeCl₃		98< /td>
CoCl₂		97
MnCl₂		97
ZnCl₂		99
CdCl₂		99
NiCl₂		96
CuSO₄		98
Pb(OAc)_{2< /sub>}		96
AgNO₃		91
HgCl₂		92
2-Mercaptoethanol	2.0	94
PCMB	1.0	98

< div class="tableWrap">< td>0.10%

Chemical	Concn.(mM)	^※Residual activity(%)
MIA	2.0	99
NEM	2.0	97
IAA	2.0	99
Hydroxylamine	2.0	98
EDTA	5.0	95
o-Phenanthroline	2.0	98
& #x3B1;,α′-Dipyridyl	1.0	96
Borate	50	98
NaF	2.0	98
NaN₃	2.0	75
Triton X-100	0.10%	98
Brij 35	0.10%	80
Tween 20	0.10%	89
Span 20	98
Na-cholate	0.10%	97
SDS	0.05%	98
DAC	0.05%	102

^※Residual activity was measured by 4AA-DEA method
4AA, 4-Aminoantipyrine; DEA, Diethylaniline
Ac,CH3CO; PCMB, p-Chloromercuribenzoate; MIA, Monoiodoacetate; NEM, NEM , Iodoacetamide;
EDTA, Ethylenediaminetetraacetate; SDS, Sodium dodecyl sulfate; DAC, Dimethylbenzylalkylammonium chloride.

Fig.1. Stability (PEO-131)
(Powder form)
(kept under dry conditions)
Fig.2. Stability (PEO-301)
(Powder form)
(kept under dry conditions)
Fig.3. Stability (PEO-302)
(Powder form)
(kept under dry conditions)
Fig.4. Stability (Powder form)
(kept under dry conditions)
Fig.5. Stability (Powder form)
(kept under dry conditions)
Fig.6. pH-Activity
20℃, 20sec-reaction in 0.1M buffer solution: pH4.0- 6.0, acetate; pH6.0-8.0, phosphate
Fig.7. Temperature activity
20sec-reaction in 0.1M phosphate buffer, pH6.0
Fig.8. pH-Stability
25℃, 20hr-treatment with 50mM buffer solution: pH3.5-6.0, acetate; pH6.0-8.0, phosphate; pH9.0-11.0 borate
< /p>
Fig.9. Thermal stability
10min-treatment with 50mM phosphate buffer, pH6.0

활성 측정법(Japanese)

1. 원리

생성하는 Purpurogallin을 에테르 추출하고 420nm의 흡광도 변화로 측정한다.

2. 정의

하기 조건 하에서 20초 동안 1.0mg의 Purpurogallin을 생성하는 효소량을 1Purpurogallin 단위(U)로 한다.

3. 시약

5%(W/V) 피로갈롤 수용액(용시 조제)

₂

0.1M 인산 완충액, pH 6.0(반응 혼액 및 효소 희석용)
NH₂SO₄ 용액

효소 용액: 효소 표본을 미리 빙냉한 0.1M 인산 완충액, pH 6.0에서 용해시키고, 동일한 완충액으로 3.0 내지 6.0 Purpurogallin U / ml로 희석하여 빙냉 보관한다.

4. 절차

1. 시험관(32φ×200mm)에 하기 반응 혼합액을 제조하고 약 5 분 동안 예비 가온한다.

< tr>

14.0ml	증류수
2.0ml	피로갈롤 수용액	(A)
1.0ml	H₂O₂ 수용액	(B)
2.0ml	인산염 완충액	(C)

2. 효소 용액 1.0ml를 첨가하여 반응을 시작한다.

3.20℃에서 정확하게 20초간 반응시킨 후, H₂SO₄ 용액 (D) 1.0ml를 첨가하여 반응을 정지시킨다. 반응 정지 후의 혼합액으로부터 생성된 Purpurogallin을 에테르 15ml로 추출한다. 이 조작을 5 회 반복하고, 추출액을 합하고, 추가로 에테르를 첨가하여 총량을 100ml로한다. 이 용액에 대해 420nm에서의 흡광도를 측정한다 (OD test).

4.맹검은 반응혼액①을 20℃으로 20초간 방치한 후, H₂ SO ₄ 용액 (D) 1.0ml를 첨가하여 혼합 한 다음 효소 용액 1.0ml를 첨가하여 제조한다. 이 액에 대해 상기와 같이 에테르 추출을 행하여 흡광도를 측정한다 (ODblank).

5. 수식

U/ml=
ΔOD(OD test-OD blank)×희석 배율
0.117×1(ml)

	= ΔOD×8.547×희석 배율
U/mg	= U/ml×1/C
0.117< /td>	: 1mg% Purpurogallin 에테르 용액의 420 nm에서의 흡광도
C	: 용해시 효소 농도(c mg/ml)
(주)1Purpurogallin 단위는 13.5 국제 단위(o-dianisidine을 기질로 하고, 25࠷의 반응 조건하)에 상당한다.