TOYOBO BIO

진단시약원료 효소

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MALATE DEHYDROGENASE

준비 및 사양

< td>젖산 탈수소효소

성상	약간 황색을 띠는 무정형 분말, 동결건조
활동	GradeII 40U/mg-solid 이상
오염물질	글루타메이트 옥살로아세트산 트랜스아미나제	≤1.0×10^-3%
	≤1.0×10^-3%
	NADH 산화효소	≤1.0×10^-3%

속성

< /tr>< td> 70℃ 미만 (pH 7.5, 15분) (그림 5)

열 안정성
안정성	−20℃에서 안정적 최소 1년 동안 (그림 1)
분자량 ¹⁾	약. 140,000
등전점 ²⁾	pH 4.8±0.1
미카엘리스 상수 ³⁾	5.4×10^-5M (L-Malate) , 5.0×10^-6M(옥살로아세테이트), 8.1×10^-6M(NADH)
구조	효소 분자당 4개의 하위 단위
억제제	Hg^＋+
최적 pH	8.0 (그림 2)
최적 온도	70℃ (그림 3)
pH 안정성	pH 3.0−9.0 ( 25℃, 20시간) (그림 4)
다양한 화학물질의 영향	(표 1)

< h2 class="ttl_bigLine">응용

이 효소는 임상 분석에서 L-말레이트 및 글루타메이트 옥살로아세트산트 트랜스아미나제(GOT)의 효소 측정에 유용합니다.

분석

원칙

Principle

NADH의 소멸은 분광 광도법으로 340nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 1개 단위는 분당 1마이크로몰의 NADH를 산화시킵니다.

방법

시약

< /tr>

K-인산염 완충액, pH 7.5	0.1M
옥살로아세트산 용액	15mM［2.0mg 옥살로아세트산(MW=132.1)/ml 얼음처럼 차가운 K-인산염 완충액(A). 이 시약은 다소 불안정하므로 사용 중에는 얼음욕조에 보관해야 합니다](신선하게 준비해야 함)
NADH 용액	6.0mM[4.25mg NADH・Na₂ (ORIENTAL YEAST, MW=709.4)/ml of H₂O] (신선하게 준비해야 함)
효소 희석제	0.1M K-인산염 완충액, pH 7.5 contg. 0.2% BSA

절차

1.다음 반응 혼합물을 큐벳(d=1.0cm)에 준비하고 30℃에서 평형화합니다. 약 5분 동안.

2.80ml	K-인산염 완충액, pH 7.5	(A)
0.10ml	옥살로아세트산 용액	(B)
0.10ml	NADH 용액	(C)

< th align="left" class="w50p">K-인산염 완충액

분석 혼합물의 농도
97 mM
옥살로아세테이트	0.49mM
NADH	0.20mM

2.0.05ml의 효소 용액*을 추가하고 가볍게 뒤집어서 혼합합니다.

3.물에 대해 340nm에서 3분간 광학 밀도 감소를 기록합니다. 30°로 온도 조절된 분광 광도계에서 4분까지 측정하고 곡선의 초기 선형 부분에서 분당 OD를 계산합니다(OD 테스트).
동시에 블랭크를 측정합니다. 시험과 동일한 방법을 사용하여 효소용액 대신 효소희석액을 첨가할 것으로 예상합니다.

*효소 제제를 얼음처럼 차가운 효소 희석제(D)에 녹이고 동일한 완충액으로 0.05−0.5U/ml로 희석한 후 얼음 위에 보관합니다.

계산

활동은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다:

< p class="txt_14">볼륨 활동(U/ml) =
ΔOD/min(Δ ;OD 테스트−ΔOD 공백)×Vt×df
6.22×1.0×Vs
= ΔOD/min×9.807×df

체중 활동량(U/mg) = ( U/ml)×1/C

Vt	: 총 용량(3.05ml)
Vs	: 시료량(0.05ml)
6.22	: 밀리몰 흡광계수 분석 조건에서의 NADH(cm²/micromole)
1.0	: 빛의 경로 길이(cm)
df	: 희석 인자
C	: 용해 시 효소 농도( c mg/ml)

참조

1) CJRThorne 및 NOKaplan; J.Biol.Chem., 238, 1861(1963).

2) RGWolfe 및 JBNeilands; J.Biol.Chem., 221, 61(1956).

3) CJRThorne; Biochim, Biophys, Acta., 59, 624(1962).

4) DJBlonde 등; Can.J.Biochem., 45, 641 (1967).

표 1. 말레이트 탈수소효소에 대한 다양한 화학 물질의 영향

h2>

[0.1M K-인산염 완충액, pH 7.5 contg에 용해된 효소 용액. 0.2% BSA(17U/ml)를 각 화학물질과 함께 25°C에서 배양했습니다. 1시간 동안.]

< tr>< td>
화학물질 농도(mM) 잔류
활동(%)
없음 - 100
금속염 2.0
MgCl₂ 100
CaCl₂ 100
Ba(OAc)₂ 101
FeCl₃ 102
CoCl₂ 100
MnCl< sub>2 102
ZnSO₄ 99
Cd(OAc)₂ 94
NiCl₂ 100
CuSO₄ 99
Pb(OAc)_{2< /sub>} 99
AgNO₃ 98
HgCl₂ 0
NEM 2.0 100
MIA 2.0 99

화학물질	농도(mM)	잔류 활동(%)
없음	-	100
금속염	2.0
MgCl₂		100
CaCl₂		100
Ba(OAc)₂		101
FeCl₃		102
CoCl₂		100
MnCl< sub>2		102
ZnSO₄	99
Cd(OAc)₂		94
NiCl₂		100
CuSO₄		99
Pb(OAc)_{2< /sub>}		99
AgNO₃		98
HgCl₂		0
NEM	2.0	100
MIA	2.0	99

< td>트윈 20< td>SDS

화학	농도(mM)	잔류 활성도(%)
2-머캅토에탄올	2.0	102
PCMB	0.1	100
IAA	2.0	99
히드록실아민	2.0	98
EDTA	5.0	99
o-페난트롤린	2.0	99
α,α ′-디피리딜	2.0	100
붕산염	5.0	99
NaF	2.0	98
NaN₃	2.0	98
트리톤 X-100	0.10%	99
브리지 35	0.10%	98
0.10%	98
스팬 20	0.10%	97
나콜레이트	0.1%	98
0.05%	95
DAC	0.05%	96

Ac, CH3CO; NEM, N-에틸말레이미드; MIA, 모노요오도아세테이트; PCMB, p-클로로머쿠리벤조에이트; IAA, 요오도아세트아미드; EDTA, 에틸렌디아민테트라아세테이트; SDS, 나트륨 도데실 황산염; DAC, 염화디메틸벤질암모늄.

그림 1. Stability (Powder form)
(kept under dry conditions)
Fig.2. PH-Activity
30℃, in 0.1M buffer solution:
pH5.5-8.0, K-phosphate:pH7.0-8.5, Tris-HCI; pH8.0-9.0, Borate

Fig.3. Temperature activity

그림 3. Temperature activity

(in 0.1mM K-phosphate buffer, pH7.5)

Fig.4. pH-Stability
25℃,20hr-treatment with 0.1M buffer solution:
pH2.0-3.5,glycine-HCI; pH3.0-6.0,acetate;
pH6.0-8.0,K- phosphate; pH8.0-9.0, Tris-HCI; pH8.5-12.0,borate
Fig.5. Thermal stability
15min-treatment with 0.1m K- phosphate buffer,pH7.5 enzyme concentration:4.0U/ml

활성 측정법(Japanese)

1. 원리

NADH의 감소를 340nm에서의 흡광도 변화로 측정한다.

2. 정의

하기 조건하에서 1분간에 1마이크로몰의 NADH를 산화하는 효소량을 1단위(U)로 한다.

3. 시약

0.1M K-인산 완충액, pH7.5
15mM 옥살로아세트산 용액(2.0mg의 옥살로아세트산(MW=132.1)을 미리 얼음 냉각한 K-인산 완충액(A) 1.0ml에 용해한다)(이 시약은 상당히 불안정하기 때문에 사용시에도 얼음 냉 보존)
6.0mM NADH 수용액[4.25mg의 NADH·Na2(오리엔탈 효모제, MW=709.4)를 증류수 1.0ml에 용해한다](용시 조제)

효소 용액: 효소 표제를 미리 빙냉한 0.2% 소혈청 알부민을 포함한 50mM K-인산 완충액, pH 7.5에서 용해하고, 같은 완충액으로 0.05~0.5U/ml로 희석하여 빙냉 보존한다.

4. 절차

1. 하기 반응 혼합물을 큐벳(d=1.0cm)으로 제조 30 ~ 약 5 분간 예비 가온한다.

2.80ml	K-인산염 완충액	(A)
0.10ml	옥살로아세트산 용액	(B)
0.10ml	NADH 수용액	(C)

2. 효소 용액 0.05ml를 첨가하고 완만하게 혼합한 후, 물을 대조에 30℃으로 제어된 분광광도계로 340nm의 흡광도 변화를 3 ~ 4 분 동안 기록하고 초기 직선 부분에서 분당 흡광도 변화를 찾습니다 (ΔOD test).

3.맹검은 반응혼액①에 효소 용액 대신에 효소 희석액 (0.2% 소혈청 알부민을 포함한 50mM K-인산 완충액, pH 7.5)를 0.05ml 첨가하고, 상기와 같이 조작을 행하여 1 분당 흡광도 변화를 구한다 (ΔOD blank).

5. 수식

U/ml=
ΔOD/min (ΔOD test−ΔOD blank)×3.05(ml)× 희석 배율
6.22×1.0×0.05(ml)

< /tr>

	= ΔOD/min×9.807×희석 배율
U/mg	= U/ml× 1/C
6.22	: NADH의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm²/micromole)
1.0	: 광로 길이(cm)
C	: 용해 시 효소 농도 (c mg/ml)