응용 프로그램

이 효소는 결합 시 혈청 내 트리글리세리드의 효소 측정에 유용합니다. L-글리세로포스페이트 산화효소(G3O-321) 및 글리세롤 키나아제(GYK-301, GYK-311). 일반적으로 반응은 37°C에서 5분 안에 완료될 수 있습니다. pH 약 7.0에서 테스트당 2.5〜3.0 단위의 효소(3.0ml)를 사용합니다.

분석< /h2>

원칙

퀴노네이민 염료의 외관은 분광광도법으로 545nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 1개 단위는 분당 1마이크로몰의 글리세롤(퀴논이민 염료의 0.5마이크로몰)을 형성합니다.

방법

시약

A. 올리브 오일 에멀젼	올리브 오일[시약 등급(고정제, 저산도)] 5.0g, 에탄올 2.0ml 및 Triton X-100 용액 5.0ml의 혼합물을 초음파 처리합니다( B) 10분 동안(20KHz). 오일 에멀젼에 4.0% BSA 용액(C) 25ml와 0.1M K-인산염 완충액(pH 7.0)(D) 15ml를 넣고 혼합한다. (새로 준비해야 함)
B. Triton X-100 용액	5.0%(5.0ml Triton X-100/100ml H2O)
다. BSA 용액	4.0%[소 혈청 알부민 4.0g/H2O 100ml]
디. K-인산염 완충액, pH 7.0	0.1M
E. TCA 용액	0.2M(삼염화초산 33g/H2O 1,000ml)
F. MES-NaOH 완충액	50mM MES 완충액, pH 6.5［2-(N-모르폴리노)-에탄술폰산(MW=195.23) 9.76g을 ca. H2O 850ml를 넣고 5.0N NaOH로 pH 6.5로 맞춘 후 H2O를 1,000ml까지 채운다
G. 발색 시약	다음 화학 물질과 효소를 50mM MES 완충액(F) 200ml에 다음 순서대로 녹입니다.
	4.0 ml	Triton X-100 용액(B)
	0.04ml	N,N-디에틸-m-톨루이딘(저어주기 완전히 용해될 때까지)
	4.0mg	4-아미노안티피린
	24.2mg	ATP・Na2・3H2O
	40.7mg	MgCl< sub>2・6H2O
	200개	글리세롤 키나아제(Toyobo, GradeIII)
	500개	L-α-글리세로포스페이트 산화효소(Toyobo, GradeIII)
	300개
	300개
td>	퍼옥시다제(푸르푸로갈린 단위)(도요보, 3급)
(갈색병에 4도 보관시 일주일간 안정함) )
H. 효소 희석제	20mM K-인산염 완충액, 2.0mM MgCl2 및 0.5mM EDTA-Na3을 함유한 pH 7.5

절차

(1단계)

1. 올리브 오일 에멀젼(A) 2.0ml를 시험관에 피펫팅하여 37°C에서 평형화합니다. 약 5분 동안.

2. 효소액* 0.2ml를 넣고 섞어주세요.

3. 37°에서 정확히 15분 후 TCA 용액(E) 2.0ml를 첨가하여 반응을 정지시키고 여과지로 여과하여 침전물을 제거합니다.

분석 혼합물의 농도
K-인산염 완충액	29.1 mM
올리브 오일	90.9mg/ml
MgCl2	0.18mM
Triton X-100	9.1%
EDTA	45μM
BSA	1.8%

< p class="txt_14">(2단계)

4.이렇게 얻은 여액 0.05ml를 피펫으로 시험관에 넣습니다.

5.발색시약(G) 3.0ml를 넣고 37℃에서 배양합니다. 15분간 더.

6.물에 대해 545nm에서 광학 밀도를 측정합니다(OD 테스트).

동시에 올리브오일 에멀젼(A) 2.0ml를 먼저 섞어서 37°C에서 15분간 배양한 후 블랭크를 준비합니다. TCA 용액 2.0ml를 첨가한 후 효소용액을 첨가한다(1단계). 혼합물로부터 얻은 여액을 이용하여 시험과 동일한 방법으로 2단계를 실시하고 545nm(OD 공백)에서 흡광도를 측정한다.

^*분석 직전에 효소 제제를 얼음처럼 차가운 효소 희석제(H)에 녹이고 동일한 완충액으로 0.9−1.6U/ml로 희석합니다.

< div class="mb30">

계산

활동은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다:

• 볼륨 활동(U/ml) =

• &# x394;OD (OD 테스트−OD 공백)×Vt-1×Vt-2×df

  ---

  28.2×1/2×1.0×t×Vs-1×Vs -2

• = ΔOD×6.057×df

체중 활동량(U/mg) = (U/ml)×1/C

Vt -1	: 1단계 총량(4.2ml)
Vt-2	: 총량 2단계 시료량(3.05ml)
Vs-1	: 1단계 시료량(0.2ml)
Vs-2	: 2단계 시료량(0.05ml)
28.2	: 분석 조건에서 퀴노네이민 염료의 밀리몰 흡광 계수(cm2/마이크로몰)
1/2	: H2O2 1몰이 퀴논이민 염료 0.5몰을 생성한다는 사실을 바탕으로 한 인수
1.0	: 빛의 경로 길이(cm)
t	: 1차 반응 시간 단계(15분)
df	: 희석 인자
C	: 용해 시 효소 농도(c mg/ml)

참조

1) T.Saiki, Y.Takagi, T.Suzuki, T. 나라사키(Narasaki), G.타무라(Tamura) 및 K.아리마(K.Arima); 농업. Biol. 화학. (Tokyo), 33, 414 (1969).

2)T.Yamaguchi, N.Muroya, M.Isobe 및 M.Sugiura; 농업. Biol. 화학. (도쿄), 37, 999(1973).

표 1. Effect of Various Chemicals on Lipoprotein lipase

[The enzyme (8 U/ml) was incubated at 25℃ for 1 hr with each chemical.]

• < td>MnCl₂< /table>

  Chemical< /th>	Concn.(mM)	Residual activity(%)
  None	-	100< /th>
  Metal salt
  CaCl2	2.0	103
  Ba(OAc)2	2.0	93
  FeCl3	2.0	97< /td>
  CoCl2	2.0	98
  2.0	82
  Zn(OAc)2< /sub>	2.0	100
  NiCl2	2.0	99
  Pb(OAc)2	2.0	76
  AgNO3	2.0	94
  HgCl2	2.0	58
  CdCl2	1.0	101
  CuSO4	1.0	1.5
  NEM	2.0	101

  < td>20.0

  Chemical	Concn.(mM)	Residual activity(%)
  PCMB	2.0	91< /td>
  MIA	2.0	95
  NaF	101
  NaN3	20.0	100
  EDTA	5.0	88
  o-Phenanthroline	2.0	100
  α,α′-Dipyridyl	2.0	96
  Borate	20.0	99
  Triton X-100< /td>	1.0%	84
  Brij 35	1.0%	99< /td>
  SDS	0.1%	91
  Tween 20	0.1%	98
  Span 20	0.1%	101
  Na-cholate	1.0%	99
  Taurocholate	0.1%	100

Ac, CH₃CO; PCMB, p-Chloromercuribenzoate; MIA, Monoiodoacetate; EDTA, Ethylenediaminetetraacetate; NEM, N-Ethylmaleimide; SDS, Sodium dodecyl sulfate; DAC, Dimethylbenzylaulkylam. class="pointList">

Fig.1. Stability (Powder form)

(kept under dry conditions)

Fig.2. pH-Activity

37℃ in 0.1M buffer solution: pH4.2-6.0,acetate; pH6.0-8.0, K-phosphate; pH8.0-9.0,Tris-HCl< /p>

Fig.3. Temperature activity

(in 0.1M K-phosphate buffer, pH7.0)

Fig.4. pH-Stability

25℃,20hr-treatment with 0.1M buffer solution: pH4.0-6.5,acatate: pH6.0-8.0,K-phosphate: pH8.0-10.0 Tris -HCl

< p class="ttl">Fig.5. Thermal stability

15min-treatment with 0.1M K-phosphate, pH7.0 enzyme concn.:20 U/ml

활성 측정법(Japanese)

1. 원리

4-Aminoantipyrine 및 N,N-Diethyl-m-toluidine의 산화 축합 생성물 인 Quinoneimine 염료를 545nm에서 측정하고, 상기 반응에서 생성 된 H _{2 O 2 한다.}

2. 정의

하기 조건에서 1분에 1 마이크로몰의 Glycerol(1/2 마이크로몰의 Quinoneimine 염료)을 생성 하는 효소량을 1단위(U)로 한다.

3. 시약

• 올리브유 에멀젼액[올리브유(나카라이테스크제, 임상 화학 연구용) 5.0g과 에탄올 2.0ml와 5.0% 트리톤 X-100 용액(B) 5.0ml의 혼합액을 10분간 초음파 처리(20KHz)하여 에멀젼을 조제한다. 이어서 이 에멀젼에 4.0% BSA 수용액(C) 25ml와 0.1MK-인산 완충액, pH 7.0(D) 15ml를 첨가 혼합한다](용시 조제)
• 5.0%(V/ V) 트리톤 X-100 용액 (5.0ml의 Triton X100 (순정)을 100ml의 증류수에 용해시킨다)
• 4.0 % 소혈청 알부민 (BSA) 수용액 의 증류수에 용해됨] 물에 용해) 50mM MES 완충액, pH 6.5 [9.76g의 2- (Nmorpholino) ethanesulfonic acid (MW = 195.23)를 약 850ml의 증류수에 용해시키고 pH를 5.0NNaOH 6.5로 조정 후 증류수로 1,000ml로한다] class="w40p">4.0ml5.0% 트리톤 X-100 용액 (B)0.04mlN,N-Diethyl-m-toluidine(완전히 용해 될 때까지 교반)4.0mg4-아미노 안티피린 24.2mgATP·Na₂·3H₂O40.7mg< td >MgCl₂·6H₂O200단위Glycerol kinase(동양방제, GradeⅢ)500단위L-α-Glycerophosphate oxidase(동양방제, GradeⅢ)300단위Peroxidase (풀프로갈린 단위)(동양방제, GradeⅢ)

(상기 발색 시약은 4℃, 갈색 병중에 보존하면 1주일은 사용 가능)

4. 절차

1.올리브유 에멀젼액(A) 2.0ml를 시험관에 채취 약 5분간 예비가온한다.

2. 효소 용액 0.2ml를 첨가하여 반응을 개시한다.

3.37℃에서 정확하게 15분간 반응시킨 후, TCA 용액(E) 2.0ml를 첨가하여 반응을 정지한다 .

4. 생성되는 불용물을 여과지 여과로 제거한다.

5. 여액의 0.05ml를 시험관에 채취하고, 발색 시약(G) 3.0ml를 첨가하여 혼합한 후, 37℃ 15 분 동안 가온하고 545 nm에서 흡광도를 측정한다 (OD test).

6.맹검은 올리브유 에멀젼액(A) 2.0ml를 37℃로 15분간 방치한 후, TCA 용액(E)2.0 ml를 첨가 한 후 효소 용액 0.2ml를 첨가하여 제조 한 후, 상기와 동일하게 (④〜⑤) 조작하여 흡광도를 측정한다 (OD blank).

5. 수식

• U/ml=

• ΔOD(OD test-OD blank)×4.2(ml)×3.05(ml)×희석 배율

  >

  ---

  28.2×1/2×1.0×15(분)×0.2(ml)×0.05(ml)