HOME준비 및 사양
| 성상 | 백색 무정형 분말, 동결건조 | |
|---|---|---|
| 활동성 | GradeⅡ 20U/mg-solid 이상 (안정제 약 70% 함유) | |
| 류실펩타이드 분해효소 | ||
| (Leu-Val) | ≤1.0×10-2% | |
| (Leu-Gly-Gly) | & #x2264;1.0×10-2% | |
| NADH 산화효소 | ≤1.0×10- 2% | |
| 안정제 | 2-머캅토에탄올, L -시스테인, 디티오트레이톨, 에틸렌디아민테트라아세트산 | |
속성
| 안정성 | −20℃에서 안정적 최소 1년 동안(그림 1) |
|---|---|
| 분자량2) | 245,000 |
| 미카엘리스 상수2) | 1.0×10 -3M(L-류신), 3.9×10-4M(NAD＋), 3.5×10-5< /sup>M(NADH), 3.1×10-4M ［α-케토이소카프로에이트(α-KⅠC)], 2.0×10-1M(NH3) |
| 구조 2) | 효소 분자당 하위 단위 6개 |
| 억제제 2) | Na2 S, Hg++, Cu++, Co++, Mg++, p-클로로머쿠리벤조에이트 | < /tr>
| 최적 pH | 10.5−10.8(L-Leu→α-KⅠC), 9.4(α-KⅠC→L-Leu)(그림 3) |
| 최적 온도 | 70℃(그림 4) |
| pH 안정성 | pH 5.5−10.5(25℃ , 20시간)(그림 5) |
| 열 안정성 | 60& 미만 #x2103; (pH 6.9, 10분)(그림 6) |
| 기질 특이성 | (표 1) |
응용 프로그램
이 효소는 L-류신 효소 측정과 류신 아미노-펩티다제 활성을 측정하는 데 유용합니다.
분석
원리
NADH의 모양은 분광광도법으로 340nm에서 측정됩니다.
단위 정의
아래 설명된 조건에서 하나의 단위는 분당 1마이크로몰의 NADH를 형성합니다.
방법
시약
| 아. L-류신 용액 | 0.2M 글리신-KCl-KOH 완충액, pH 10.5에 담긴 0mM L-류신(새로 준비) | |
|---|---|---|
| B. NAD+ 용액 | 12.5mM (신선하게 준비해야 함) | |
| C. 효소 희석제 | 25mM K-인산염 완충액, pH 7.2 | |
절차
1. 다음 반응 혼합물을 큐벳(d=1.0cm)에 준비하고 37°C에서 평형화합니다. 약 5분 동안.
| 3.0ml | 기질 용액 | (A) |
| 0.3ml | NAD＋ 솔루션 | (B) |
| 분석 혼합물의 농도 | |
|---|---|
| 글리신 버퍼 | 0.18M |
| L- 류신 | 18mM |
| NAD+ | 1.1mM |
2. 효소액 0.05ml*를 넣고 가볍게 뒤집어 섞어주세요.
3. 37°로 온도가 조절된 분광 광도계에서 물에 대해 2~3분 동안 340nm에서 광학 밀도의 증가를 기록하고 곡선의 초기 선형 부분에서 분당 OD를 계산합니다(&# x394;OD test).
동시에 효소희석액(C )가 효소 용액 대신 첨가됩니다.
*효소 제제를 얼음처럼 차가운 효소 희석제(C)에 녹입니다. (ca. 5mg/ml) 분석 직전에 동일한 완충액으로 0.25−0.33U/ml로 희석합니다.
계산
활동은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다:
용적 활동(U/ml) =
ΔOD/min(ΔOD 테스트−Δ ;OD 공백)×Vt×df
6.22×1.0×Vs
= ΔOD/min×10.77×df
체중 활성도(U/mg) = (U/ml)×1/ C
| Vt | : 총 용량(3.35ml) |
| Vs | : 샘플량(0.05ml) |
| 6.22 | : NADH의 밀리몰 흡광계수(㎡/micromole) |
| 1.0 | : 빛의 경로 길이(cm) |
| df | : 희석 인자 |
| C | : 용해 중 효소 농도(c mg/ml) |
참조
1) K.Soda 외. ; Biochem.Biophys.Res.Commun., 44, 931(1971).
2) T.Ohshima et al. ; J.Biol.Chem., 253, 5719 (1978).
표 1. 류신 탈수소효소의 기질 특이성2)
기질(10mM) 상대활성도(%) < td>L-류신 100 L-발린 74 < td>L-이소류신 58 L-노르발린 41 < td>L-노르류신 10 L-메티오닌 0.6 < td>L-시스테인 0.3 불활성:L-Ala, L-Glu, L-Thr , L-Ser
Gly, L-Phe, L-Lys,
L-Arg, D-Leu, D-Val, D-Ile기질(10mM) 상대활성도(%) α-케토이소카프로에이트 100 α-케토이소발레레이트 126 α-케토발레레이트 76 α-케토부티레이트 57 α-케토카프로에이트 46 불활성:피루브산,α-케토글루타레이트 ,
페닐피루베이트, 옥살로아세트산,
글리옥실레이트
그림 1. 안정성(분말 형태)
(건조한 조건에서 보관)
그림 2. 안정성(분말 형태)
(건조한 조건에서 보관)
그림 3. pH-활동
○̶̶& #x25CB; :α-KIC→1M 암모늄 완충액의 Leu ●̶̶ ;● :0.2M 글리신KOH 완충액의 Leu→α-KIC 
그림 4. 온도 활동
○̶̶&# x25CB; :α-KIC→1.0M 암모늄 완충액 pH9.5의 Leu ●̶ ̶● :0.2M 글리신-KOH 완충액pH10.5의 Leu→α-KIC - < p class="img imgAuto txtCenter">
그림 5. pH-안정성
50mM 완충액으로 25℃,20시간 처리: pH4.0-6.0,아세테이트; pH6.0-8.5,인산염;pH9.0-11.0, 탄산염:
○̶ ̶○ :0.01% 메르캅토에탄올 함유 ●̶̶ ;● :메르캅토에탄올 제외 
그림 6. Thermal stability
10min-treatment with 50mM phosphate buffer,pH6.9
활성 측정법(Japanese)
1. 원리
하기 조건하에서 1분간에 1 마이크로몰의 NADH를 생성하는 효소량을 1단위(U)로 한다.
3. 시약
- 20mM L-류신 용액[L-류신을 20mM가 되도록 0.2M글리신- KCl-KOH 완충액(pH 10.5)에 용해한다](용시 조제)
- 12.5mM NAD+수용액(용시 조제)
효소 용액: 효소 표품을 미리 빙냉한 25mM K-인산 완충액, pH 7.2로 용해(약 5mg/ml)하고, 분석 직전에 같은 완충액으로 0.25~ 0.33U/ml로 희석.
4. 절차
1. (d = 1.0cm)로 준비하고 약 5 분 동안 예비 가온한다.
| 3.0ml | 기질 용액 | ( A) |
| 0.3ml | NAD+ 수용액 | (B) | < /tr>
2. 효소 용액 0.05ml를 첨가하고 완만하게 혼합한 후, 물을 대조군에 37℃ 에 제어된 분광광도계로 340nm의 흡광도 변화를 2~3분간 기록하고, 그 초기 직선 부분으로부터 1분간 당의 흡광도 변화를 구한다(ΔOD test).
4.맹검은 반응혼액①에 효소 용액 대신에 효소 희석액(25mM K-인산 완충액, pH7.2) 0.05ml를 첨가하고 상기와 동일한 조작을 행하여 1 분당 흡광도 변화를 구한다 (ΔODblank).
5. 수식
U/ml=
ΔOD/min (ΔOD test−ΔOD blank)×3.35(ml)× 희석 배율
6.22×1.0×0.05(ml)
| = ΔOD/min×10.77×희석 배율 | |
| U/mg | = U/ml× 1/C |
| 6.22 | : NADH의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm2/micromole) | < /tr>
| 1.0 | : 광로 길이(cm) |
| C | : 용해 시 효소 농도 (c mg/ml) |
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