진단시약원료 효소

준비 및 사양

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성상황색 무정형 분말, 동결건조
활동GradeⅢ 80U/mg-solid 이상
오염물질피루브산 산화효소≤1.0×10-3%
콜레스테롤 산화효소 ≤1.0×10-3%
Uricase≤ 1.0×10-3%
포도당산화효소≤1.0×10-3%

속성

< td>7.5(그림 2)
안정성−20℃에서 안정적 최소 1년 동안(그림 1)
분자량 대략. 160,000(겔 여과 기준)
등전점4.3±0.2
미카엘리스 상수1.0×10-3M(L-락테이트)
억제제Fe+++, SDS
최적 pH
최적 온도35− 40℃(그림 3)
pH 안정성4.0 −9.8(25℃, 16시간)(그림 4)
열 안정성 th>50℃ 미만 (pH 7.0, 10분)(그림 5)
다양한 화학물질의 영향 (표 1)
< h2 class="ttl_bigLine">응용

이 효소는 L-락테이트의 효소 측정에 유용합니다.

분석

원리

퀴노네이민 염료의 외관은 분광광도법으로 555nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 1개 단위는 분당 1마이크로몰의 과산화수소(퀴논이민 염료의 0.5마이크로몰)를 형성합니다.

방법

시약

A. DL-Lactate 용액0.125M [DL-유산리튬 240mg(MW=96.01)/50mM K-PB pH7.5 20ml](신선하게 준비해야 함)
B. 4-AA 용액0.5%(4-아미노안티피린 500mg/H2O 100ml)(갈색병에 4℃ 보관)
다. EHSPT(TOOS) 용액20mM [591mg N-에틸-N-(2-하이드록시-3-설포프로필)-m-톨루이딘(MW=295.3)/100ml H2O] (갈색병에 4℃ 보관)
D. 퍼옥시다제 용액25U/ml [ca. 양 고추냉이 과산화효소 23mg(Toyobo GradeIII, 110 푸르푸로갈린 단위/mg)/100ml H2O]
E. SDS 용액0.25%(도데실황산나트륨 500mg/H2O 200ml)
F. 효소 희석제20mM K-PB, pH7.0 0.1%(w/v) 콜산나트륨 함유

절차

1. 다음 작업 용액(20개 테스트)을 갈색 병에 준비하고 얼음 위에 보관하세요.

8.0 mlDL-Lactate 용액(A)
1.2ml4-AA 솔루션(B)
0.8mlEHSPT 솔루션(C)
2.0ml과산화효소 용액(D)
8.0ml증류수
분석 혼합물의 농도
K-인산염 완충액20 mM
DL -젖산48mM
4-아미노안티피린 1.2mM
EHSPT0.76mM
과산화효소2.4 U/ml

2. 1.0ml의 작업 용액을 시험관에 피펫으로 넣고 37°C에서 평형을 이루게 합니다. 약 5분 동안.

3. 효소액 0.05ml*를 넣고 섞어주세요.

4. 37°에서 정확히 15분 후 SDS 용액(E) 2.0ml를 추가하여 반응을 중지하고 물에 대한 광학 밀도를 555nm에서 측정합니다(ODtest).

동시에 효소용액(ODblank) 대신 효소희석액(F)을 사용한 것을 제외하고는 시험방법과 동일한 방법으로 공시험액을 준비한다.

< span>*1mM EDTA 및 0.5%(w/v) 콜산나트륨이 함유된 얼음처럼 차가운 20mM ACES-NaOH pH7.0에 효소 제제를 용해시키고 0.04−0.1U로 희석합니다. 분석 직전에 효소 희석제(F)로 /ml

계산

활동량은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다:

  • 활동량(U/ml) =

  • ΔOD(OD 테스트−OD 공백)×Vt×df

    34.3×1/2×t×1.0×Vs

  • = ΔOD×0.237×df

체중활동량(U/mg) = (U/ml)×1/C

Vt: 총 용량(3.05ml)
Vs: 시료량(0.05ml)
34.3: 분석 조건에서 퀴노네이민 염료의 밀리몰 흡광계수(㎡/micromole) )
1/2: H2O 1몰이 2 0.5몰의 퀴논이민 염료를 생성했습니다
t: 반응 시간(15분)
1.0: 빛의 경로 길이(cm)
C: 용해 중 효소 농도(C mg/ml)

참조

1) A. Toda, 및 Y. Nishiya; J. 발효. Technol., 85, 507 (1998)

표 1. Effect of Various Chemicals on Lactate oxidase

[The enzyme solution dissolved in 20mM ACES-NaOH, pH7.0 (50U/ml) was incubated with each chemical at 25℃ .]

  • < th align="left">100
    ChemicalConcn.(mM)Residual
    activity(%)
    None-
    Metal salt2.0
    MgCl2100
    CaCl2 101
    Ba(OAc)2101
    FeCl35
    CoCl2100
    MnCl 2100
    ZnCl2 94
    Cd(OAc)291< /td>
    NiCl299
    CuSO494
    AgNO354
    MIA2.094
    NEM2.099
  • ChemicalConcn.(mM)Residual
    activity(%)< /th>
    IAA2.090
    Hydroxylamine2.099
    EDTA5.094< /td>
    o-Phenanthroline2.0100
    α ,α′-Dipyridyl2.094
    Borate50.097
    NaF2.099
    NaN32.0100
    Triton X-100 0.10%98
    Brij 350.10%86
    Tween 200.10%81
    Span 200.10 %96
    Na-cholate0.10%101
    DAC0.05%76
    SDS0.05%< /td>0

Ac, CH3 CO; MIA, Monoiodoacetate; NEM, N-ethylmaleimide; IAA, Iodoacetate; EDTA, Ethylenediaminetetraacetate; SDS, Sodium dodecyl sulfate; DAC, Dimethylbenzylalkylammonium chloride.

Fig.1. Stability (Powder form)

그림 .1. Stability (Powder form)

(kept under dry conditions)

  • Fig.2. pH-Activity

    Fig.2. pH-Activity

    (37℃, in 20mM buffer solution
    ●, pH5.7-7.9 K-phosphate;
    ○, pH8.2-9.0 borate;
    &# x25A0;, pH8.6-9.6 glycine-NaOH)

  • Fig.3 . Temperature activity

    Fig.3. Temperature activity

    (in 20mM K-phosphate , pH7.5)

  • Fig.4. pH-Stability

    Fig.4. pH-Stability

    (25℃, 16hr-treatment with 50mM buffer solution:
    ●, pH3.6-5.0 acetate;
    ○, pH5.6-7.8 K-phosphate;
    ■, pH7.5-8.5 Tris-HCl; □, pH8.9-10.2 glycine-NaOH)

  • Fig.5. Thermal stability

    Fig.5. Thermal stability

    (10min-treatment with 20mM ACES-NaOH, pH7.0. Enzyme concentration: 100U/ml)

    • 활성 측정법(Japanese)

    1. 원리

    4-Aminoantipyrine과 EHSPT의 산화 축합물인 Quinoneimine 염료를 555nm에서 측정하고, 상기 반응에서 생성된 H2O2 을 정량한다.

    2. 정의

    하기 조건 하에서 1분에 1 마이크로몰의 H2O2를 생성하는 효소량을 1단위(U) 한다.

    3. 시약

    • 0.125M DL-락트산 용액[240mg의 DL-락트산 리튬(MW=96.01) )를 50mM K-PB pH 7.5에 용해시키고 최종 액량을 20ml로한다. ] (용시 조제)
    • 0.5% 4-AA 수용액(500㎎의 4-아미노 안티피린을 증류수에 용해하고, 최종 액량을 100ml로 한다.) (갈색병 중에서 4℃ 보존)
    • 20m M EHSPT(TOOS) 수용액(591mg의 EHSPT(MW=295.3)을 증류수에 용해시키고, 최종 액량을 100ml로 한다.)(갈색병 중에서 25U / ml POD 수용액 (약 23mg의 양고추 유래 퍼 옥시다아제 (도요 보제, Grade III) (110 풀 프로 갈린 단위 / mg)를 냉 증류수에 용해시키고 최종 액량 를 100ml로 한다.

      효소 용액: 효소 표품을 미리 빙냉한 1.0mM EDTA, 0.5%(w/v) 콜산나트륨을 포함하는 20mMACES-NaOH, pH 7.0으로 용해하고, 분석 직전에 0.1 % (w / v) 나트륨 콜레이트를 함유하는 20mMK- 인산 완충액, pH 7.0으로 희석한다.

      4. 절차

      1. 병에서 얼음 냉각 저장)

      8.0mlDL-젖산 용액(A)
      1.2ml4-AA 수용액(B)
      0.8mlEHSPT 수용액 (C)
      2.0mlPOD 수용액(D)
      8.0ml증류수
      < p class="txt_14 numList">2. 반응 혼합물 1.0ml를 시험관에 채취하고, 약 5분간 예비가온한다.

      3. 효소 용액 0.05ml를 첨가하여 반응을 개시한다.

      4.37℃로 정확하게 15분 반응시킨 후, SDS 수용액(E) 2.0ml를 첨가하여 반응을 정지시킨다 . 이 액체 당 물을 대조군으로 555 nm에서의 흡광도를 측정한다 (ODtest).

      5. 맹검은 효소 용액 대신 효소 희석액[0.1%(w/v) 콜산 나트륨을 포함하는 20 mM K-인 산 완충액, pH 7.0]을 사용하여 상기와 같이 조작하여 흡광도를 측정한다 (ODblank).

      5. 수식

      • U/ml=

      • ΔOD(OD test-OD blank)×3.05(ml)×희석 배율

        < p class="txt_14">34.3×1/2×15(분)×1.0×0.05(ml)

      < td>= ΔOD×0.237×희석 배율
      U/mg= U/ml×1/C
      34.3: Quinoneimine 염료의 상기 측정 조건 하에서 밀리몰 분자 흡광 계수(cm2/micromole)< /td>
      1/2: 효소 반응으로 생성된 H2O2의 1분자로부터 형성되는 Quinoneimine 색소는 1/2분자인 것에 의한 계수
      1.0: 광로 길이(cm)
      C: 용해 때 효소 농도 (c mg/ml)

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