HOME준비 및 사양
| 성상 | 백색 무정형 분말, 동결건조 | |
|---|---|---|
| 활동 | GradeⅡ 400U/mg-solid 이상 | |
| 오염물질 | NADH 산화효소 | ≤1.0×10-3% |
| 말산염 탈수소효소 | ≤1.0×10-2% | |
| 득템 | ≤ 5.0×10-3% | |
| GPT | ≤5.0×10-3% | |
| 미오카나제 | ≤1.0×10-2% | 피루브산 키나제 | ≤1.0×10-3% |
속성
| 안정성 | -20℃에서 안정 |
|---|---|
| 분자량 | 약. 140,000 |
| 등전점 | 4.0 |
| 미카엘리스 상수 | 1.6×10-4M(피루브산, pH 7.0) |
| 억제제 | Ag2＋, Hg2＋, SH 시약 |
| 최적 pH | 6.0~7.0(그림 2) |
| 최적 온도 | 35~40℃(그림 3) |
| pH 안정성 | pH 5.0~9.0(25℃, 48시간)(그림 4) |
| 열 안정성 | 45℃ 이하 (pH 7.0, 15분)(그림 5) |
| 다양한 화학물질의 영향 | (표 1) |
이 효소는 ATP, ADP, 포도당, 크레아티닌, 피루브산염, 젖산염 및 글리세롤과 같은 수많은 대사산물과 효소 활성을 효소적으로 측정하는 데 유용합니다. , 예: 관련 효소와 결합된 경우 GPT, PK 및 CPK.
분석
원칙
NADH의 소멸은 분광 광도법으로 340nm에서 측정됩니다.
단위 정의
아래 설명된 조건에서 1개 단위는 분당 1마이크로몰의 NADH를 산화시킵니다.
방법
시약
| 아. 피루브산 용액 | 5.0mM[5.50mg 피루브산 나트륨(MW=110)/10ml H2O](신선하게 준비해야 함) | |
|---|---|---|
| B. K-인산염 완충액, pH 7.4 | 1.0M | |
| C. NADH 용액 | 1.0mM[7.63mg NADH・2Na(MW=763)/10ml H2O](신선하게 준비해야 함) | |
| 디. 효소 희석제 | 0.1M K-인산염 완충액, pH 7.4 contg. BSA 0.1% | |
절차
1. 사용 직전에 갈색 병에 다음 작업 용액(10개 테스트)을 준비하고 얼음 위에 보관하세요.
| 3.0ml | 기질 용액 | (A) |
| K-인산염 완충액, pH 7.4 | (B) | |
| 3.0ml< /td> | NADH 용액 | (C) |
| 22.0ml | H 2O | (D) |
| 분석 혼합물의 농도 | |
|---|---|
| K-인산염 완충액 | 67 mM |
| 피루브산 | 0.49mM |
| NADH | 0.098mM |
| BSA | 16.4μg/mM |
2. 작업 용액 3.0ml를 큐벳(d=1.0cm)에 피펫팅하고 25℃에서 평형화합니다. 약 5분 동안.
3. 효소 용액 0.05ml*를 넣고 가볍게 뒤집어 섞어주세요.
4. 25°로 온도가 조절된 분광 광도계에서 물에 대해 2~3분 동안 340nm에서 광학 밀도의 감소를 기록하고 곡선의 초기 선형 부분에서 분당 OD를 계산합니다. (ΔOD 테스트).
동시에 테스트와 동일한 방법으로 블랭크율(ΔΔOD)을 측정합니다. 효소액 대신 효소희석액을 첨가해야 합니다.
*효소제를 0.2~1.0U/로 희석하세요. 얼음처럼 차가운 효소 희석제(D)를 첨가한 ml, 분석 직전.
계산
활동량은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다:
활동량(U/ml) =
ΔOD/min (ΔOD 테스트-ΔOD 공백)×Vt×df
6.22×1.0×Vs
= ΔOD/min ×9.81×df
체중 활동도(U/mg) = (U/ml)×1/C
| Vt | : 총 용량(3.05ml) |
| Vs | : 시료량(0.05ml) |
| 6.22 | : NADH의 밀리몰 흡광계수( cm2/마이크로몰) |
| 1.0 | : 빛의 경로 길이(cm) |
| df | : 희석 인자 |
| C | : 용해시 효소 농도(c mg/ml) |
참조
1) CALoshon, RBMcComb, LWBond, GNBowers, Jr.WHColeman 및 RHGwynn; Clin.Chem., 23, 1576(1977).
2) H.Taguchi, M.Machida, H.Matsuzawa 및 T.Ohta; Agric.Biol.Chem., 49(2), 359(1985).
3) F.Gasser, M.Doudoroff 및 R. 콘토풀로스; J.Gen. 미생물. 62, 241 (1970).
표 1. D-락테이트 탈수소효소에 대한 다양한 화학물질의 영향
[0.1M K-인산염 완충액, pH 7.4(20U/ml)에 용해된 효소를 각 화학물질과 함께 25°C에서 배양했습니다. 1시간 동안.]
화학물질 농도(mM) 잔류
활동(%)없음 - 100 금속염 2.0 MgCl2 100 CaCl2 96.3 Ba(OAc)2 95.8 FeCl3 94.4 CoCl2 97.3 MnCl< sub>2 96.9 Cd(OAc)2 97.2 NiCl2 95.5 CuSO4 94.3 Pb(OAc)2 96.0 AgNO3< /sub> 71.5 화학 < th align="center" class="w20p">농도(mM)잔류
활성도(%)MIA 2.0 92.4 NaF < td>2.098.0 NaN3 20 97.2 EDTA 5.0 96.0 o-페난트롤린 2.0 98.0 α,α'-디피리딜 1.0 97.1 붕산염 50 97.5 IAA 2.0 91.6 NEM 2.0 95.2< /td> 하이드록실아민 2.0 96.3 트리톤 X-100 0.10% 105.5 브리지 35 0.10% 104.1 트윈 20 0.10% 106.3 스팬 20 0.10% 98.2 나콜레이트 0.10% 102.1 SDS 0.05% 104.4 DAC < td>0.05%47.6
Ac, CH3CO; MIA, 모노요오도아세테이트; EDTA, 에틸렌디아민테트라아세테이트; IAA, 요오도아세트아미드; NEM, N-에틸말레이미드; SDS, 나트륨 도데실 황산염; DAC, 디메틸벤질알킬암모늄 클로라이드.
그림 1. Stability (Powder form)
(kept under dry condition, 37℃)
< img src="/inday_fileinfo/img/v520240422194449." alt="Fig.2. pH-Activity">
Fig.2. pH-Activity
in 57mM buffer solution: pH 4-5, acetate; pH 5-8, K-phosphate; pH 8-9, Tris-HCl
Fig.3. Temperature activity
(in 67mM K-phosphate buffer, pH 7.4)
Fig.4. pH-Stability
25℃, 48hr-treatment with 0.1M buffer solution: pH 4-6, dimethylglutaric acid-NaOH; pH 6-8, K-phosphate; pH 8-9, Tris-HCl; pH 9-10, glycine-NaOH Enzyme concentration: 10U/ml
Fig.5. Temperature stability
15min-treatment with 50mM K-phosphate buffer, pH 7.0. Enzyme concentration: 10U/ml< /p>
활성 측정법(Japanese)
1. 원리
NADH의 소실량을 340nm의 흡광도 변화로 측정한다.
2. 정의
몰의 NADH가 산화되는 효소량을 1단위(U)로 한다.
3. 시약
- 5.0mM 피루브산나트륨 수용액(용시 조제)
- 1.0 M K-인산완충액, pH 7.4 /li>
- 효소 희석액: 0.1% BSA를 포함하는 0.1M K-인산 완충액, pH 7.4
효소 용액: 효소 표품 미리 빙냉 된 효소 용해액 (D)으로 용해시키고 분석 직전에 효소 희석액 (E)으로 0.2 & # x301C; 1.0U / ml로 희석한다.
4. 절차
1.하기 반응 혼합물을 사용 직전에 제조한다. (갈색 병에서 얼음 냉각 저장)
| 3.0ml | 기질 용액 | (시약 A) |
| 2.0ml | K-인산 완충 액체 | (시약 B) |
| 3.0ml | NADH 수용액 | (시약 C) |
| 22.0ml | H2 O |
2. 반응 혼합물 3.0ml를 큐벳(d=1.0cm)에 넣고, 25℃에서 약 5분간 예비가온한다.
3. 효소 용액 0.05ml를 첨가하고 완만하게 혼합한 후, 물을 대조군에 25℃로 제어된 분광 광도계 340 nm의 흡광도 변화를 2 & 301C;
4.맹검은 반응혼액①3.0ml에 효소 용액 대신에 효소 희석액(E) 0.05ml를 첨가, 상기와 같이 조작을 행하여 1분간당의 흡광도 변화를 구한다(ΔODblank).
5. 수식
U/ml=
ΔOD/min (ΔOD test-ΔOD blank)×3.05(ml)× 희석 배율
6.22×1.0×0.05(ml)
| = ΔOD/min×9.81×희석 배율 | |
| U/mg | = U/ml× 1/C |
| 6.22 | : NADH의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm2/micromole) | < /tr>
| 1.0 | : 광로 길이(cm) |
| C | : 용해 시 효소 농도 (c mg/ml) |
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