TOYOBO BIO

진단시약원료 효소

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준비 및 사양

< tbody>< tr>

성상	백색 무정형 분말, 동결건조
활동	GradeⅡ 400U/mg-solid 이상
오염물질	NADH 산화효소	≤1.0×10^-3%
	말산염 탈수소효소	≤1.0×10^-2%
	득템	≤ 5.0×10^-3%
	GPT	≤5.0×10^-3%
	미오카나제	≤1.0×10^-2%
	피루브산 키나제	≤1.0×10^-3%

속성

< th align="left">열 안정성

안정성	−20℃에서 안정적 최소 1년 동안(그림 1)
분자량	대략. 140,000(겔 여과 기준)
등전점	4.0
미카엘리스 상수	1.6×10^-4M(피루브산염, pH 7.0)
억제제	Ag⁺, Hg⁺⁺, SH-시약
최적 pH	6.0−7.0(그림 3)
최적 온도	35−40℃(그림 4)
pH 안정성	pH 5.0−9.0(25℃, 48시간)(그림 5)
45℃ 미만 (pH 7.0, 15분)(그림 6)
다양한 화학물질의 영향	(표 1)

< h2 class="ttl_bigLine">응용 프로그램

이 효소는 ATP, ADP, 포도당, 크레아티닌, 피루브산염, 젖산염 및 글리세롤과 같은 수많은 대사산물과 효소 활성을 효소적으로 측정하는 데 유용합니다. 예를 들어 관련 효소와 결합 시 GPT, PK 및 CPK.

분석

원칙

NADH의 소멸은 분광 광도법으로 340nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 1개 단위는 분당 1마이크로몰의 NADH를 산화시킵니다.

방법

시약

아. 피루브산 용액	5.0mM[5.50mg 피루브산 나트륨(MW=110)/10ml H₂O](신선하게 준비해야 함)
B. K-인산염 완충액, pH 7.4	1.0M
C. NADH 용액	1.0mM[7.63mg NADH・2Na(MW=763)/10ml H₂O](신선하게 준비해야 함)
디. 효소 희석제	0.1M K-인산염 완충액, pH 7.4 contg. BSA 0.1%

절차

1. 사용 직전에 갈색 병에 다음 작업 용액(10개 테스트)을 준비하고 얼음 위에 보관하세요.

< td class="w20p">3.0ml< td class="w20p">22.0ml

3.0ml	기질 용액	(A)
2.0ml	K-인산염 완충액, pH 7.4	(B)
NADH 솔루션	(C)
H₂O	(D)

< tr>< td align="right">16.4μg/mM

집중 분석 혼합물에서
K-인산염 완충액	67mM
피루브산	0.49mM
NADH	0.098mM
BSA

<스팬>2. 작업 용액 3.0ml를 큐벳(d=1.0cm)에 피펫팅하고 25℃에서 평형화합니다. 약 5분 동안.

3. 효소 용액 0.05ml^*를 넣고 가볍게 뒤집어 섞어주세요.

4. 25°C로 온도 조절된 분광 광도계에서 물에 대해 2~3분 동안 340nm에서 광학 밀도의 감소를 기록하고 곡선의 초기 선형 부분에서 분당 OD를 계산합니다(Δ ;OD test).
동시에 효소용액 대신 효소희석액을 첨가하는 것을 제외하고는 시험과 동일한 방법을 이용하여 바탕율(ΔOD 바탕)을 측정한다.

^*분석 직전에 얼음처럼 차가운 효소 희석제(D)를 사용하여 효소 제제를 0.2−1.0U/ml로 희석합니다.< /p>

계산

다음 공식을 사용하여 활동을 계산할 수 있습니다.

볼륨 활동(U/ml) =
ΔOD/min (ΔOD 테스트−ΔOD 공백)×Vt×df
6.22×1.0 ×Vs
= ΔOD/min×9.81×df

체중활동량(U/mg) = (U/ml)×1/C

Vt	: 총 용량(3.05ml)
Vs	: 샘플 용량(0.05ml)
6.22	: NADH의 밀리몰 흡광계수(cm²/마이크로몰)
1.0	: 빛의 경로 길이(cm)
df	: 희석 인자
C	: 용해 시 효소 농도(c mg/ml)

참조

1) CALoshon, RBMcComb, LWBond, GNBowers, Jr.WHColeman 및 RHGwynn; Clin.Chem., 23, 1576(1977).

2) H.Taguchi, M.Machida, H.Matsuzawa 및 T.Ohta; Agric.Biol.Chem., 49 (2), 359 (1985).

3) F.Gasser, M.Doudoroff 및 R. 콘토풀로스; J.Gen.미생물. 62, 241(1970).

표 1. Effect of Various Chemicals on D-Lactate dehydrogenase

[The enzyme dissolved in 0.1M K-phosphate buffer, pH 7.4 (20U/ml) was incubated with each chemical at 23&# for 1hr.]

< tr>< td>
Chemical Concn.(mM) Residual
activity(%)
None - 100
Metal salt 2.0
MgCl₂ 93.0
CaCl₂ 99.8
Ba(OAc)₂ 98.1
FeCl₂ 87.9
CoCl₂ 91.5
MnCl< sub>2 92.2
ZnSO₄ 89.6
Cd(OAc)₂ 91.3
NiCl₂ 92.6
CuSO₄ 93.8
Pb(OAc)_{2< /sub>} 93.2
AgNO₃ 73.0
HgCl₂ 0

Chemical	Concn.(mM)	Residual activity(%)
None	-	100
Metal salt	2.0
MgCl₂		93.0
CaCl₂		99.8
Ba(OAc)₂		98.1
FeCl₂		87.9
CoCl₂		91.5
MnCl< sub>2		92.2
ZnSO₄	89.6
Cd(OAc)₂		91.3
NiCl₂		92.6
CuSO₄		93.8
Pb(OAc)_{2< /sub>}		93.2
AgNO₃		73.0
HgCl₂		0

< td>o-Phenanthroline< td>Span 20

Chemical	Concn.(mM)	Residual activity(%)
PCMB	2.0	89.3
MIA	2.0	0.1
NaF	2.0	98.3
NaN₃	20< /td>	94.6
EDTA	5.0	99.2
2.0	95.3
α,α′-Dipyridyl	1.0	93.7
Borate	50	95.6
IAA	2.0	33.6
NEM	2.0	97.7
Hydroxylamine	2.0	95.6
Triton X-100	0.10%	121
Brij 35	0.10%	116
Tween 20	0.10%	117
0.10%	105
Na-cholate	0.10%	112
SDS	0.05%	109
DAC	0.05%	52.0

Ac, CH₃CO;PCMB, p-Chloromercuribenzoate; MIA, Monoiodoacetate; EDTA, Ethylenediaminetetraacetate; IAA, Iodoacetamide; NEM, N-Ethylmaleimide; DDS, Sodium Dimethylbenzylalkylammonium chloride.

Fig.1. Stability (Powder form)
(kept under dry conditions)
Fig.2. Stability (Powder form)
(kept under dry conditions)
Fig.3. pH-Activity

in 67mM buffer solution; pH 4-5, acetate;pH5-8,K-phosphate;pH8-9 Tris-HCI
Fig.4. Temperature activity
< p class="txt">(in 67mM K-phosphate buffer, pH7.4)
Fig.5. pH-Stability
25℃,48hr -treatment with 0.1M buffer solution: pH 4-6, dimethylgutaric acid-NaOH;pH6-8, K-phosphate; pH 8-9,Tris-HCI; pH9-10,glycine-NaOH. enzyme concn.: 10U/ml
Fig.6. Temperature stability
15 min-treatment with 50mM K-phosphate buffer,pH7.0.enzyme concn.: 10U/ml
< /li>

활성 측정법(Japanese)

1. 원리

NADH 소실량 340nm의 흡광도 변화로 측정한다.

2. 정의

산화되는 효소량을 1단위(U)로 한다.

3. 시약

5.0mM 피루브산나트륨 수용액(용시 조제)
1.0 M K-인산 완충액, pH 7.4
1.0mM NADH 수용액(용시 조제)

효소 용액: 분석 직전에 효소 표본을 미리 얼음 냉각 된 0.1 % BSA를 함유하는 0.1M K- 인산 완충액, pH 7.4에서 용해 (약 1mg / ml)하고 분석 직전에 동일한 완충액으로 0.2 & # x301C; 1.0U / ml 에 희석한다.

4. 절차

1.하기 반응 혼합물을 사용 직전에 제조한다. (갈색 병에서 얼음 냉각 저장)

< td>(C)

3.0ml	기질 용액	(A)
2.0ml	K-인산 완충액	(B)
3.0ml	NADH 수용액
22.0ml	H₂O

2. 반응 혼합물 3.0ml를 큐벳(d=1.0cm)에 채취, 25℃ ;로 약 5분간 예비가온한다.

3. 효소 용액 0.05ml를 첨가하고, 완만하게 혼화 후, 물을 대조에 25℃로 제어된 분광 광도계 340 nm의 흡광도 변화를 2 ~ 3 분간 기록하고, 초기 직선 부분으로부터 1 분간 당 흡광도 변화를 구한다 (ΔOD test).

4. 맹검은 반응 혼합물 ①3.0ml에 효소 용액 대신에 효소 희석액 (0.1% BSA를 포함하는 0.1M K- 인산 완충액, pH 7.4)을 0.05ml 첨가하고, 상기와 같이 조작하여 1 분당 흡광도 변화를 구한다 (ΔODblank).

5. 수식

U/ml=
ΔOD/min (ΔOD test−ΔOD blank)×3.05(ml)× 희석 배율
6.22×1.0×0.05(ml)

< /tr>

	= ΔOD/min×9.81×희석 배율
U/mg	= U/ml× 1/C
6.22	: NADH의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm²/micromole)
1.0	: 광로 길이(cm)
C	: 용해 시 효소 농도 (c mg/ml)