진단시약원료 효소

IVH-101

준비 및 사양

성상백색 무정형 분말, 동결건조
활동성GradeⅠ 100U/mg-solid 이상
(안정제 약 70% 함유)
안정기KH2PO4

속성

안정성안정적 −20℃ 최소 1년 동안(그림 1)
분자량 약. 260,000
미카엘리스 상수 1.5×10-2M(자당)
구조 대략적인 당단백질을 함유하고 있습니다. 탄수화물 50%
최적 pH 3.5−4.0(그림 .3)
최적 온도 60−70℃(그림 4)
pH 안정성 pH 4.0−6.0 (50℃, 10분)(그림 5)
열 안정성 60℃ 미만 (pH 4.5, 10분)(그림 6)
기질 특이성< /th> 이 효소는 자당과 라피노스를 가수분해하지만 이눌린과
멜레지토스는 가수분해하지 않습니다. 6)

응용

이 효소는 자당의 효소적 결정과 -D-프럭토푸라노사이드 잔기를 함유한 탄수화물의 구조 조사에 유용합니다.< /p>

분석

원칙

Principle

환원당의 출현은 수정된 Fehling-Lehmann-Schoorl 방법으로 측정합니다. 7)

단위 정의

하나의 단위는 아래 설명된 조건 하에서 3분 동안 포도당과 동등한 환원당 1mg이 형성됩니다(이 활동은 동일한 온도에서 분당 1마이크로몰의 자당을 가수분해하는 국제 단위와 동일합니다).

방법

시약

< tr>< tr>
아. 자당 용액5.0%[자당 5.0g/80mM 아세트산 완충액 100ml, pH 4.5(보존을 위해 톨루엔 2~3방울 추가)]
나. 알칼리 용액(NaOH 103g, 로셸염 346g・4H2O/H2O 1,000ml)
다. CuSO4 용액6.93%(69.3g CuSO4・5H2O/1,000ml H2O)
D. KI 용액30%(300g KI/1,000ml H2O)(갈색병에 보관)
마. H2SO4 솔루션25%
에프. Na2S2O3 용액50mM(49.638g Na2< /sub>S2O3・5H2O, 4.0g Na2CO3< /sub> (안정제)/4,000ml H2O)(갈색병에 담아 3~4일 보관한 후 사용)
G. 수용성 전분 용액2.0%(끓여서 녹임)(신선하게 준비해야 함)
H. 효소 희석제50mM 아세트산 완충액, pH 4.5
< /div>

절차

1. 기질용액(A) 1.0ml를 시험관에 피펫팅하여 20°C에서 평형화시킵니다. 약 5분 동안.

2. 효소 용액(20°C에서 사전 배양) 1.0ml를 추가하고 혼합합니다.

< tr>
분석 혼합물의 농도
아세트산 완충액65mM
자당73mM

3. 20도에서 정확히 3분 후 알칼리용액(B) 2.0ml를 넣어 반응을 멈춥니다.

동시에 먼저 블랭크를 준비해주세요 기질용액을 20°C에서 3분간 배양한 후 알칼리용액 2.0ml와 혼합한 후 효소용액을 첨가하여 시험과 동일한 과정을 실시한다(과정 4-8).

4. 중단된 반응 혼합물을 시험관에서 100ml 용량의 삼각 플라스크로 옮깁니다. 약 3ml의 증류수로 시험관 내부를 헹구고, 헹궈진 액을 플라스크에 옮긴다. 이 과정을 3번 반복하세요.

5. CuSO4 용액(C) 2.0ml를 넣고 부딪히는 것을 방지하기 위해 유리구슬(5mmφ)이 있는 상태에서 플라스크를 전열 히터(1.2KWH) 위에 직접 올려 놓습니다.

6. 끓는 상태에서 정확히 2분간 보관한 후 흐르는 물에 실온까지 식혀주세요.

7. KI 용액(D)과 H2SO4 용액(E)을 각각 2.0ml씩 순서대로 첨가하세요.

8. 플라스크를 흔들어 지시약으로 가용성 전분(G) 몇 방울을 두고 Na2S2O3 용액(F)으로 적정하여 잔류 Cu++의 양을 측정합니다.

<스팬>9. 시험액(t)과 공시험액(b)의 역가(ml)를 기록하고 적정 차이(Δtiter, ml)를 계산합니다.

*효소 제제를 얼음처럼 차가운 증류수에 녹이고 분석 직전에 효소 희석액(H)을 사용하여 2.0~9.0U/ml로 희석합니다.

계산

활동은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다:

  • 볼륨 활동(U/ml) =

  • Δ역가(b−t)×F×df

    0.600×Vs

  • = Δ역가×F×1.66×df

체중 활성도(U/mg) = (U/ml)×1/C

< /tbody>
Vs: 시료량(1.0ml)
0.600: 50mM Na2S2<의 적정 차이(ml) /sub>O3 환원당(포도당) 1.0mg을 위한 용액(F=1.00)
F: 50mM Na2S2O3의 농도 인자(F는 각 시간마다 iodotimemetry 방법으로 결정해야 함) 준비).
C: 용해 시 효소 농도(c mg/ml)

참조

1) H.네고로; J.Agric.Chem.Soc. (일본), 31, 253(1957).

2)K.Myrbck; 효소(2판) Vol. 14, p.379 (1960), AP.

3)T.Kaya; J.Agr.Chem.Soc. (일본), 38, 417(1964).

4)J.Hoshino 및 A.Momose; J.Gen.Appl.Microbiol., 12, 163(1966).

5)O.Lampen et al. ; J.Biol.Chem., 243, 1573(1968).

6)H.Negoro; J.Ferment, Technol., 51, 879, (1973).

7)T.Yamamoto, J.Kumada 및 T.Sawai; Bull.Agric.Biol.Chem.Soc. (일본); 21, 185(1957).

  • 그림 1. 안정성(분말 형태)

    그림 1. 안정성(분말 형태)

    (건조한 조건에서 보관)

  • 그림 2. 안정성(분말 형태)

    그림 2. 안정성(분말 형태)

    (건조한 조건에서 보관)

  • 그림 3. pH-활성도

    그림 3. pH-활성

    20℃, 다음 완충 용액에서 3분간 반응:pH2〜3,0.1M 글리신HCl; pH4~5,50mM 아세테이트; pH6〜7,50mM 인산염

  • 그림 4. 온도 활동

    그림 4. 온도 활동

    (50mM 아세트산 완충액, pH4.5에서 3분간 반응)

  • 그림 5. pH-안정성

    그림 5. pH-안정성

    50℃, 다음 완충액으로 10분간 처리: pH2〜3,0.1M 글리신-HCl; pH4~5,50mM 아세테이트; pH6〜8,50mM 인산염

  • 그림 6. 열 안정성

    그림 6. 열 안정성

    (50mM ace tatebuffer, pH4.5로 10분 처리)

活性測정법(일본어)

1. 원본

원리

還元糖の生成weightをFehling-Lehman-Schoorl법을 활용하여 결정합니다.

2. 정의

下記条件下下下地3分単位(U)로 설정됩니다.

3. 시약

  • 5.0% 사카로스 용액(5.0g의 사카로스를 80mM 아세트산 완충액, pH 4.5에 용해하여 100ml로 한다(방부를 위해 톨루엔 2〜 ; 3 방울을 적가하십시오)) 1,000ml로한다)
  • 6.93% 황산구리 용액(69.3g의 CuSO4·5H2O)를 증류수에 용해시키고, 1,000 ml로한다)
  • 30% 요오드화칼륨 용액(300g의 KI를 증류수에 용해하고, 1,000ml로 한다)(갈색병에 보존)
  • 25%황산 용액
  • 50 mM 나트륨 티오설페이트 용액(49.638 g의 Na2S2O3·5H2 O 및 4.0g의 Na2CO3를 증류수에 용해시키고, 4,000ml로 한다. x301C; 4일 방치하여 사용한다. li>

효소 용액: 효소 표제를 미리 빙냉된 증류수에 용해시키고, 분석 직전에 50mM 아세트산 완충액, pH 4.5에서 2.0〜9.0 U/ ml로 희석한다.

4. 절차

1. 시험관에 기질 용액(A) 1.0ml를 채취, 20℃에서 약 5분간 예비가온한다.

2. 미리 20℃에 조온된 효소 용액 1.0ml를 첨가하여 반응을 개시한다.

3.20℃에서 정확하게 3분간 반응시킨 후, 로셸염 알칼리 용액(B) 2.0ml 첨가하여 반응을 정지 하자.

4. 반응 정지 후의 혼액을 약 100ml 용삼각 플라스크에 옮기고, 시험관을 약 3ml의 증류수로 3회 세정한다. 삼각 플라스크에 회수한다.

5. 황산구리 용액(C)을 2.0ml 첨가하고, 돌비 방지를 위해 직경 5mmφ의 유리 구슬 1개를 넣어 전기 히터로 가열한다.

6. 끓인 상태에서 정확하게 2분간 유지한 후, 유수 중에서 실온까지 냉각한다.

7. 요오드화칼륨 용액(D) 2.0ml 및 황산 용액(E)2.0ml를 이 순서에 가하고 잘 섞은 후 50mM 티오황산나트륨 용액(F)으로 적정한다. (지시약으로서 2ĭC;3방울의 가용성 전분액(G)을 첨가해 둔다)(tml).

8. 맹검은 기질 용액(A) 1.0ml를 20℃으로 3분간 방치한 후, 로셸염 알칼리 용액(B) 를 첨가하여 혼화시킨 후, 효소 용액 1.0ml를 첨가하여 조제한다. 다음 절차를 사용하여 적정 값을 얻습니다 (b ml).

5. 수식

  • U/ml=

  • 적정값 차이(b ml-t ml)×F× 희석 배율

    0.600×1.0(ml)

= 적정값의 차이×F×1.66×희석 배율< /td>
U/mg= U/ml×1/C
0.600: 환원당(글루코오스) 1.0mg에 상당하여 생기는 50mM 티오황산나트륨 용액(F=1.00)의 적정치차(ml/mg)
F: 50mM 티오황산나트륨 용액의 농도 보정 계수
C: 용해 시 효소 농도 (c mg/ml)

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