TOYOBO BIO

진단시약원료 효소

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HBD-301

준비 및 사양

성상	백색 무정형 분말, 동결건조
활동	GradeⅢ 100U/mg-solid 이상
오염물질	말산염 탈수소효소	≤2.0×10^-3%
	젖산염 탈수소효소	≤2.0×10^-3%
	NADH 산화효소	≤2.0×10^-3%
안정제	자당 , 만니톨, BSA

속성

< td>−20℃에서 안정적 최소 1년 동안(그림 1)

안정성
분자량	대략. 130,000(겔 여과 기준)
등전점	5.6±0.1
미카엘리스 상수	4.2×10^-4M(25℃, pH8.3), 7.0×10^-4M(37℃, pH8.3)(D-3-하이드록시부티레이트)
	4.9×10^-5 M(25℃, pH8.3), 7.2×10^-5M(37℃, pH8.3)(NAD^＋)
	8.1×10^-5M(25℃, pH7.1), 2.4×10^-4M(37&# x2103;, pH7.1)(아세토아세트산)
	8.4×10^-6M(25℃, pH7.1), 1.5× 10^-5M(37℃, pH7.1)(NADH)
억제제	PCMB, MIA, IAA, Ag⁺, Hg⁺⁺, SDS, DAC
최적 pH	8.3(그림 3)
최적 온도	55℃(그림 4)
pH 안정성	pH 5.0−8.5(25℃, 20시간)(그림 5)
열 안정성	40℃ 이하 (pH 6.5, 15분)(그림 6)
기질 특이성	(표 1)
다양한 화학물질의 영향	(표 2)

애플리케이션

이 효소는 임상 분석에서 케톤체(D-3-하이드록시부티레이트 및 아세토아세테이트)의 효소적 측정에 유용합니다.

분석

원칙

Principle

NADH의 모양은 분광광도법으로 340nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 하나의 단위는 분당 1마이크로몰의 NADH를 형성합니다.

방법

시약

아. Tris-HCl 완충액, pH 8.5(25℃)	0.1M
B. 3-하이드록시부티레이트 용액	158mM[200mg D,L-3-하이드록시부티레이트 Na 염(MW=126.09)/10ml Tris-HCl 완충액(A)](최소 5일 동안 안정함) 4℃)
C에 저장된 경우. NAD⁺ 용액	NAD⁺ 용액: 27.9 mM(Tris-HCl 완충액(A)에 용해됨)(100℃에서 안정함) 4℃에서 보관 시 최소 5일)
D. 효소 희석제	0.1M Tris-HCl 완충액, pH 8.5 contg. 0.1% BSA

절차

1. 다음 반응 혼합물을 큐벳(d=1.0cm)에 준비하고 37°C에서 평형화합니다. 약 5분 동안.

2.3ml	Tris-HCl 완충액, pH 8.5	(A)
0.5ml	기질 용액	(B)
0.2ml	NAD^＋ 솔루션	(C)

분석 혼합물의 농도
Tris-HCl 버퍼	0.1M
3-하이드록시부티레이트	25mM
NAD^＋	1.8mM

<스팬>2. 효소액 0.1ml를 넣고^* 가볍게 뒤집어 섞어주세요

3. 37℃로 온도 조절된 분광 광도계에서 물에 대해 2~3분 동안 340nm에서 광학 밀도의 증가를 기록합니다. 곡선의 초기 선형 부분에서 분당 OD를 계산합니다(OD 테스트).

동시에 블랭크 비율(Δ #x394;OD 공백) 효소용액 대신 효소희석액을 첨가하는 것을 제외하고는 시험과 동일한 방법으로 시행하였다.

^* 효소 제제를 얼음처럼 차가운 효소 희석제(D)에 녹이고 동일한 완충액으로 0.1−0.5U/ml로 희석한 후 얼음 위에 보관합니다.

계산

활동은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다:

볼륨 활동(U/ml) =
ΔOD/분( ΔOD 테스트−ΔOD 공백)×Vt×df
6.22×1.0×Vs
= ΔOD/min×4.98×df

체중 활동(U/mg ) = (U/ml)×1/C

Vt	: 총 부피(3.1 ml)
Vs	: 샘플량(0.1ml)
6.22	: 340nm에서 NADH의 밀리몰 흡광계수(㎡/micromole)
1.0	: 광선 길이(cm)
df	: 희석 계수
C	: 용해 시 효소 농도(c mg/ml)

참조

1) HUBergmeyer, K.Gawehn, H.Klotzsh , HAKrebs 및 DHWilliamson; Biochem.J., 102, 423(1967).

2) FPDelafield, KECooksey 및 M.Doudoroff; J.Biol.Chem., 240, 4023(1965).

3) CWShuster 및 M.Doudoroff; J.Biol.Chem., 237, 603(1962).

4) I.Sekuzu, P.Jurtshuk 및 DEGreen; J.Biol.Chem., 238, 975(1963).

5) JDSmiley 및 G.Ashwell; J.Biol.Chem., 236, 357 (1961).

표 1. D-3-하이드록시부티레이트 탈수소효소의 기질 특이성

< ul class="picList">

< td>0< td>0

기질	상대활성도(%)
3-하이드록시부티레이트	100
3-하이드록시프로피오네이트	0.14
락테이트
글리세레이트	0
2-하이드록시부티레이트	0
L-말레이트	0
D,L-말레이트

기판	상대 활동( %)
sec-부틸 알코올	0
글루코네이트	0
글리콜산염	0.04
NAD⁺	100
NADP⁺	4.74

표 2. Effect of Various Chemicals on D-3-Hydroxybutyrate dehydrogenase

[The enzyme dissolved in 50 mM K-phosphate buffer, pH 6.5(10U/ml) was incubated at 25& 1hr.]

< /tr>< td>CuSO₄
Chemical Concn.(mM) Residual< br>activity(%)
None - 100
Metal salt 2.0
MgCl₂ 105
CaCl₂ 101
Ba(OAc)₂ < /td> 98
FeCl₃ 101
CoCl₂ 102
MnCl₂ 103
ZnSO₄ 100
Cd(OAc)₂ 100
NiCl₂ 103
83
Pb(OAc)₂ 96
AgNO₃ 2.5
HgCl₂ 0
PCMB 2.0 0
MIA 2.0 1

Chemical	Concn.(mM)	Residual< br>activity(%)
None	-	100
Metal salt	2.0
MgCl₂		105
CaCl₂		101
Ba(OAc)₂	< /td>	98
FeCl₃		101
CoCl₂		102
MnCl₂		103
ZnSO₄		100
Cd(OAc)₂		100
NiCl₂		103
	83
Pb(OAc)₂		96
AgNO₃		2.5
HgCl₂		0
PCMB	2.0	0
MIA	2.0	1

Chemical	Concn .(mM)	Residual activity(%)
NaF	2.0	100
NaN₃	20	104
EDTA	5.0	97
o-Phenanthroline	2.0	96
α,α′-Dipyridyl	1.0	97
Borate	50	103
IAA	2.0	4
NEM	2.0	59
Hydroxylamine	2.0	101
Triton X-100	0.10%	113
Brij 35	0.10%	37
Tween 20	0.10%	68
Span 20	0.10%	104
Na-cholate	0.10%	107
SDS	0.05%	5
DAC	0.05%	4

Ac, CH₃CO; PCMB, p-Chloromercuribenzoate; MIA, Monoiodoacetate; EDTA, Ethylenediaminetetraacetate; IAA, lodoacetamide; NEM, N-Ethylmaleimide; SDS, Sodium Dimethylbenzylalkylammonium chloride.

Fig.1. Stability (Powder form)
(kept under dry conditions)
Fig.2. Stability (Powder form)
(kept under dry conditions)
Fig.3. pH-Activity

37℃,5min-reaction in 0.1M buffer solution: pH5.3-6.5, dimethylglutaric acid-NaOH;pH5.9-8.3,K-phosphate;pH7.9-9.1,Tris -HCI: pH8.9-9.2,K₂CO₃-NaHCO₃
Fig.4. Temperature activity
(in 0.1M Tris-HCI buffer, pH8.3)
Fig.5.pH-Stability
25&# x2103;,20hr-treatment with 50mM buffer solution:pH4.0-6.0, dimethylglutaric acidNaOH;pH6.0-8.0, K-phosphate;pH8.0-9.0, Tris-HCI;pH9.0-10.5, K_{CO₃-NaHCO₃}
Fig.6. Thermal stability
15min-treatment with 50mM K-phosphate buffer,pH6.5. enzyme concn.:50U/ml

활성 측정법(Japanese)

1. 원리

NADH의 생성량을 340nm의 흡광도 변화로 측정한다.

2. 정의< /p>

하기 조건하에서 1분간에 1 마이크로몰의 NADH를 생성하는 효소량을 1단위(U)로 한다.

3. 시약

0.1M Tris-HCl 완충액, pH 8.5 (25℃)
158mM 3-하이드록시부티르산 용액(200mg의 D,L-3-하이드록시부티르산 나트륨염(MW=126.09)을 10ml의 Tris-HCl 완충액(A)에 용해)(4℃ , 적어도 5일간 사용 가능)
27.9mM NAD⁺용액(Tris-HCl 완충액(A)에 용해한다)(4℃ 보존으로, 적어도 5일간은 사용 가능)

효소 용액: 효소 표본을 미리 빙냉한 0.1% 소혈청 알부민을 포함하는 0.1M Tris-HCl 완충액, pH 8.5에서 용해 그런 다음 완충액으로 0.1 ~ 0.5 U / ml로 희석하여 얼음 냉 보관한다.

4. 절차

1. 하기 반응 혼합물을 큐벳(d=1.0cm)으로 제조 37 ~ 약 5 분간 예비 가온한다.

2.3ml	0.1MTris-HCl 완충액	(A)
0.5ml	기질 용액	(B)
0.2ml	NAD^{+< /sup>용액}	(C)

2.< / span> 효소 용액 0.1ml를 첨가하고 완만하게 혼화 한 후, 물을 대조군으로 37 & # x2103;로 제어 된 분광 광도계로 340nm의 흡광도 변화를 2 ~ 3 분간 기록하고, 그 초기 직선 부분으로부터 1 분당 흡광도 변화를 구한다(ΔOD test).

3. 맹검은 반응 혼합물 ①에 효소 용액 대신에 효소 희석액 (0.1% 소 혈청 알부민을 포함하는 0.1MTris -HCl 완충액, pH 8.5)를 0.1ml 첨가하고, 상기와 같이 조작을 행하여 1분간 당의 흡광도 변화를 구한다(ΔOD blank).

5. 수식

U/ml=
ΔOD/min (ΔOD test−ΔOD blank)×3.1(ml)× 희석 배율
6.22×1.0×0.1(ml)

< /tr>

	= ΔOD/min×4.98×희석 배율
U/mg	= U/ml× 1/C
6.22	: NADH의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm²/micromole)
1.0	: 광로 길이(cm)
C	: 용해 시 효소 농도 (c mg/ml)

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