진단시약원료 효소

HBH-311

준비 및 사양

< tr>
성상황색 무정형 분말, 동결건조
활동성GradeⅢ 20U/mg-solid 이상
(안정제 약 40% 함유)
오염물질NADPH 산화효소 ≤1.0×10-1%
안정제설탕, 유행

애플리케이션

이 효소는 프로토카테츄에이트 3, 4-다이옥시게나제(PCO-302)와 결합될 때 콜린 에스테라제의 효소적 측정에 유용합니다.

분석

원칙

Principle

NADPH의 소멸은 분광 광도법으로 340nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 1개 단위는 분당 1마이크로몰의 NADPH를 산화시킵니다.

방법

시약

아. 트리스-말산염 완충액, pH 8.250mM［3.03g의 트리스(MW=121.14)를 약 300ml의 H2O에 녹이고 조정한 후 25℃에서 pH를 8.2로; 1.0M 말레산으로, H2O로 최대 500ml를 채웁니다.]
B. p-히드록시벤조에이트 용액5.0mM［80mg p-히드록시벤조에이트(Na염)/완충용액(A) 100ml](신선하게 준비해야 함)
다. FAD 용액0.2mM[19mg FAD・Na2 /100ml 또는 완충액(A)](신선하게 준비해야 함)
디. NADPH 용액3.0mM［272mg NADPH・Na4・4H2O/완충액(A) 100ml]( 신선하게 준비해야 함)
E. 효소 희석제50mM K-인산염 완충액, pH 6.0, 0.2% BSA 함유

2. 작업 용액 3.0ml를 큐벳(d=1.0cm)에 피펫팅하여 37°C에서 평형화합니다. 약 5분 동안.

3. 효소 용액 0.05ml*를 넣고 가볍게 뒤집어 섞어주세요.

4. 37℃로 온도가 조절된 분광 광도계에서 3~4분간 물에 대해 340nm에서 광학 밀도의 감소를 기록합니다. 곡선의 1.5~3분 부분에서 분당 OD를 계산합니다(OD 테스트).

동시에 블랭크 비율( ΔOD 공백) 효소액 대신 효소희석액(E)을 첨가하는 것을 제외하고는 시험과 동일한 방법으로 시행한다.

* 효소 제제를 얼음처럼 차가운 효소 희석제(E)(1.0mg/ml 이상)에 녹이고 분석 직전에 동일한 완충액으로 0.2−0.6 U/ml로 희석합니다.

계산

활동은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다:

  • 볼륨 활동(U/ml) =

  • ΔOD/min (ΔOD 테스트−ΔOD 공백)×Vt×df

    6.22×1.0×Vs

  • = ΔOD/min×9.8×df

체중 활동량(U/mg) = (U/ml)×1/C

td>

참조

1) H .Shoon 및 K.Arima; Protein, Nucleic acid and Enzyme, 25, 820, (1980).

2) K.Yano 및 K.Arima; Agric.Biol.Chem., 33, 689(1969).

3) K.Hosokawa 및 RYStanier; J.Biol.Chem., 241, 2453 (1966).

표 1. p-하이드록시벤조에이트 수산화효소의 기질 특이성

Vt : 총 용량(3.05ml)
Vs: 샘플 용량(0.05ml)
6.22: NADPH의 밀리몰 흡광계수(cm2/마이크로몰)
1.0: 광선 길이(cm)
df: 희석 계수
C: 효소 농도(c mg/ml)
< td>에틸-p-하이드록시벤조산
기판( 0.5mM)상대활성도(%)
p-하이드록시벤조산 100
메틸-p-히드록시벤조산<0.05
<0.05
n-프로필-p-하이드록시벤조산<0.05
m-히드록시벤조산<0.05
o-히드록시벤조산
  • < td>p-클로로벤조산
    기판상대 활동( %)
    프로토카테츄익산3.3
    β ;-레조르사이클산4.5
    겐티스산<0.05
    <0.05
    p-아미노벤조산0.12

    • 표 2. Effect of Various Chemicals on p-Hydroxybenzoate hydroxylase (Residual activity after 1 hr-treatment at 30℃)

    • < td>1.0 td>< td>FeCl3
      ChemicalConcn.(mM )Residual
      activity(%)
      None-100
      Metal salt
      CoCl2106
      ZnCl294
      CuSO4103
      AgNO30
      MgSO4107
      BaCl2107
      106
      MnCl2< /td>90
      NiCl2104
      CaCl297
      SnCl2102
      HgCl21.1
      CrCl2 93
      CdCl2104
      FeSO490
    • < tr>< td>Span 20
      ChemicalConcn.(mM)Residual
      활동(%)
      MIA1.091
      PCMB1.03.7
      NaN31.0 97
      NaF1.096
      o -Phenanthroline1.095
      α,α′-Dipyridyl1.090
      EDTA5.096
      Borate50104
      Tween 200.1%91
      Brij 350.1%101
      0.1%94
      Triton X-1000.1%97
      Na-cholate0.1%88
      SDS0.05%34

    MIA, Monoiodoacetate; PCMB, p-Chloromercuribenzoate; EDTA, Ethylenediaminetetraacetate; SDS, Sodium dodecyl sulfate.

    • Fig.1. Stability (Powder form)

      Fig.1. Stability (Powder 양식)

      (kept under dry conditions)

    • Fig.2. Stability (Liquid form at 25℃)

      Fig.2. Stability (Liquid form at 25℃)< /p>

      enzyme concentration:500U/ml buffer compostion:50mM K-phosphate buffer,pH6.0

    • Fig.3. pH-Activity

      Fig.3. pH-Activity

      37℃ in 50mM buffer solution:○̶̶○,K-phosphate; △̶̶&# x25B3;,Trismalate

    • Fig.4. Temperature activity

      Fig.4. Temperature activity

      (in 50mM Tris-malate buffer, pH8.2)

    • Fig.5. pH-Stability

      Fig.5. pH -Stability

      25℃ in 72hr-treatment with 50mM buffer solution:△̶̶△,acetate; ○ ̶̶○,K-phosphate;×̶̶×,glycine-NaOH

    • Fig.6. Thermal stability

      Fig.6. Thermal stability

      15min-treatment with 50mM K-phosphate buffer,pH6.0

    활성 측정법(Japanese)

    1. 원리

    원리

    NADPH의 소실량을 340nm의 흡광도 변화로 측정한다.

    2. 정의

    하기 조건하에서 1분간에 1마이크로몰의 NADPH가 산화되는 효소량을 1단위(U)로 한다.

    3. 시약

    • 50mM Tris-malate 완충액 pH8.2(3.03g의 Tris(MW=121.14) 약 300ml의 증류수에 용해시키고, 1.0M 말레 산으로 pH를 8.2 (25 & # x2103;)로 조정 한 후 증류수로 500ml로 만든다). (80mg의 p- 히드 록시 벤조산 나트륨을 100ml의 완충액 (A)으로 용해시킨다) (사용시 제조)
    • 0.2mM FAD 용액 약 100ml의 완충액 (A)에 용해) (용시 제조) 3.0mM NADPH 용액 (272mg NADPH · Na 4 O를 약 100ml의 완충액 (A)으로 용해시킨다. 0.2% BSA를 함유하는 50mM K-인산 완충액 pH 6.0으로 용해(1.0mg/ml 이상)하고, 분석 직전에 동일한 완충액으로 0.2~0.6U/ml로 희석한다.

      4. 절차

      1. 항아리에 얼음 차가운 저장).

      < td class="w20p">(A)< td class="w20p">(B)< td class="w20p">(C)< td class="w20p">(D)
      21.0mlTris-malate 완충액
      3.0ml기질 용액
      3.0mlFAD 솔루션
      3.0mlNADPH 용액

      2. 반응 혼합물 3.0ml 큐벳 (d=1.0cm)에 채취하고, 37℃로 약 5분간 예비 가온한다.

      3. 효소 용액 0.05ml를 첨가하고 완만하게 혼합한 후, 물을 대조군으로 37℃로 제어된 분광 광도계 340nm의 흡광도 변화를 1.5~3.0분간 기록하고, 그 1.5~3분간의 흡광도로부터 1분간 당의 흡광도 변화를 구한다(ΔODtest).

      4. 맹검은 반응 혼합물에 효소 용액 대신에 효소 희석액 (0.2% BSA를 포함하는 50mM K-인산 완충액 pH6 .0)을 0.05ml 첨가하고, 상기와 동일한 조작을 행하여, 1분간 당의 흡광도 변화를 구한다(ΔOD blank).

      5. 수식

      • U/ml=

      • ΔOD/min (ΔOD test−ΔOD blank)×3.05(ml)× 희석 배율

        6.22×1.0×0.05(ml)

      < /tr>
      = ΔOD/min×9.8×희석 배율
      U/mg= U/ml× 1/C
      6.22: NADPH의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm2/micromole)
      1.0: 광로 길이(cm)
      C: 용해 시 효소 농도 (c mg/ml)

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