진단시약원료 효소

HXK-311

준비 및 사양

성상백색 무정형 분말, 동결건조
활동GradeⅢ 150U/mg-solid 이상
오염물질인산글루코스 이소머라제≤1.0×10-1%
6-포스포글루코네이트 탈수소효소≤1.0×10-2%
글루코스-6-인산 탈수소효소< /td>≤1.0×10-2%
미오카나제≤1.0 ×10-2%
글루타티온 환원효소≤5.0×10-1%

속성

th>
안정성 −20℃에서 안정적 최소 1년 동안(그림 1)
분자량 대략. 82,000(겔 여과 기준)
등전점4.1±0.1
미카엘리스 상수2.3×10-4M(D-글루코스), 7.7×10-5M(ATP)
억제제금속 이온, p-클로로머쿠리벤조에이트, 요오도아세트아미드, SDS 등
최적 pH8.0−9.0(그림 2)
최적 온도50& #x2103;(그림 3)
pH 안정성pH 4.0 −9.0(25℃, 20시간)(그림 4)
열 안정성
45℃ 미만 (pH 7.0, 30분)(그림 5)
기질 특이성(표 1)
다양한 화학물질의 영향(표 2)

애플리케이션

이 효소는 포도당-6-인산 탈수소효소(=G-6-PDH, G6D311)와 결합할 때 포도당, 아데노신-5'-삼인산(ATP) 및 크레아틴 포스포키나제의 효소적 측정에 유용합니다. G6D-321).

분석

원칙

원칙

Principle

NADH의 모양은 분광광도법으로 340nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 하나의 단위는 분당 1마이크로몰의 NADH를 형성합니다.

방법

시약

< tr>
아. Tris-HCl 완충액, pH 8.050mM, 13.3mM MgCl2
비. 포도당 용액0.67M in Tris-HCI 완충액(A) (사용 전 최소 1시간 동안 실온에 보관해야 함)
다. ATP 용액16.5mM in Tris-HCl 완충액(A)(신선하게 준비해야 함)
디. NAD＋ 용액6.8mM in Tris-HCl 완충용액(A)(신선하게 준비해야 함)
마. G-6-PDH 용액300U/ml (Tris-HCl 완충액(A)으로 희석하여 얼음 위에 보관)
F. 효소 희석제Tris-HCl 완충액(A) contg. 소혈청알부민 0.1%

절차

1. 큐벳(d=1.0cm)에 다음 반응 혼합물을 준비하고 30°C에서 평형화합니다. 약 5분간 담가주세요.

2.30mlTris-HCl 완충액 (A)
0.50ml포도당 용액 (B)
0.10mlATP 솔루션 (C)
0.10mlNAD< sup>+ 용액(D)
0.01mlG-6-PDH 솔루션(E)
< tr>< th align="left">포도당
분석 혼합물의 농도
Tris-HCl 버퍼50mM
0.11M
ATP0.53mM
NAD+0.22mM
MgCl213mM
BSA3.2μg/ml
G -6-PDHca.1.0 U/ml

2. 효소액 0.1ml*를 넣고 가볍게 뒤집어 섞어주세요.

3. 30°C로 온도가 조절된 분광 광도계에서 4~5분 동안 물에 대해 340nm에서 광학 밀도의 증가를 기록합니다. 그리고 곡선의 초기 부분에서 분당 OD를 계산합니다(OD 테스트).

동시에 블랭크 비율(Δ ;OD 공백) 효소용액 대신 효소희석액(F)을 첨가하는 것을 제외하고는 시험과 동일한 방법으로 시행한다.

* 분석 직전에 효소 제제를 얼음처럼 차가운 효소 희석제(F)에 녹이고 동일한 완충액으로 0.1−0.3U/ml로 희석합니다.

계산

활동은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다:

  • 볼륨 활동(U/ml) =

  • ΔOD/분( OD 테스트−OD 공백)×Vt×df

    6.22×1.0×Vs

  • = ΔOD/min×5.0×df

체중 활동도(U/mg) =(U/ml)× 1/C

< td class="w10p">C
Vt: 총 용량(3.11ml)
Vs: 샘플량(0.1ml)
1.0: 빛의 경로 길이(cm)
6.22: NADH의 밀리몰 흡광 계수(cm 2/마이크로몰)
df: 희석 인자
: 용해 시 효소 농도(c mg/ml)

표 1. 헥소키나제의 기질 특이성

[0.1M Tris-HCl 완충액, pH 7.5를 사용한 피루베이트 키나제-락테이트 탈수소효소 시스템]

  • 기질(100mM)상대활성도(%)
    D-포도당100
    D-과당140
    D-만노스52
    2-데옥시-D-글루코스91
  • 기질(100mM)상대활성도(%)
    D-갈락토스0
    D-자일로스2< /td>
    D-글루코사민58

    • 표 2. 다양한 화학물질이 헥소키나제에 미치는 영향

    [50mM K-인산염 완충액, pH 6.5(5U/ml)에 용해된 효소 contg . 0.1% bovine serum albumin was incubated with each chemical at 30℃ for 1hr.]

    • < td>2.0< /tr>
      ChemicalConcn.(mM)Residual
      activity(%)
      None< /th>-100
      Metal salt
      AgNO32.00
      BaCl22.099
      CaCl22.098
      CdCl285
      CoCl22.085
      CuSO42.025
      FeCl32.028
      FeSO42.080
      HgCl22.00
      MgCl22.098
      MnCl22.0100
      NiCl< sup>22.0100
      Pb(OAc)2< /td>2.098
      Zn(OAc)22.0< /td>98
      ZnSO42.099
      NaF20.0101
      NaN3 20.0102
      • < li class="mt20">
      < td>1.0%< td>0.1%< /tr>
      ChemicalConcn.(mM)Residual
      activity(%)
      PCMB2.00
      MIA 2.080
      IAA2.07
      EDTA5.0103
      (NH4)2 SO420.0104
      Borate20.0102
      o-Phenanthroline2.0101
      α,α′-Dipyridyl2.0102
      Urea 2.0104
      Guanidine2.0103
      Hydroxylamine2.0104
      Na-cholate102
      Triton X-1001.0%105
      Brij 351.0%0
      SDS25
      Tween 200.1%101
      Span 200.1%106
      DAC 0.1%101

    Ac, CH 3CO; NEM, N-Ethylmaleimide; PCMB, p-Chloromercuribenzoate; MIA, Monoiodoacetate; EDTA, Ethylenediaminetetraacetate; IAA, Iodoacetamide; SDS, Sodium dodecyl sulfate; DAC, Dimethyl. ul class="pointList">

  • Fig.1. Stability (Powder form)

    Fig.1. Stability (Powder form)

    (kept under dry conditions)

  • Fig.2. pH-Activity

    Fig.2. pH- Activity

    30℃ in the 50mM buffer solution: pH6.2-7.5, PIPES-NaOH: pH7.5-9.0, Tris-HCI: pH9.0-10.0, Glycine -NaOH

  • Fig.3. Temperature activity

    < p class="ttl">Fig.3. Temperature activity

    (in 50mM Tris-HCI buffer,pH8.0)

  • Fig.4. pH-Stability

    Fig.4. pH-Stability

    25℃, 20hr-treatment in the 0.1M buffer solution: pH4.0-8.0,Acetate-NaOH;pH6.0-8.0, K-phosphate;pH7.5 -9.0,Tris-HCl;pH9.0-10.5, Glycine-NaOH enzyme concn.: ca.10U/ml

  • Fig.5. Thermal stability

    Fig.5. Thermal stability

    30min- treatment with 50mM K-phosphate buffer, pH7.0, containing 0.1% bovine serum albumin enzyme concn.: ca.5U/ml

활성 측정법(Japanese)

1. 원리

원리

NADH의 생성량을 340nm의 흡광도 변화로 측정한다.

2. 정의

하기 조건 하에서 1분에 1 마이크로몰의 NADH를 생성하는 효소량을 1단위(U) 한다.

3. 시약

  • 50mM Tris-HCl 완충액, pH 8.0 (13.3mM MgCl2 포함)
  • 0.67M 포도당 완충액 (시약 A에서 용해) (용해 후 실온에서 적어도 1 시간 동안 보관 한 것을 사용)
  • 16.5mM ATP 용액 (시약 A에서 용해) (용시 조제)
  • 6.8mM NAD+용액(시약 A로 용해)(용시 조제)
  • G-6-PDH 용액(300U/mg에 시약 A로 희석) 얼음 냉각 저장)

효소 용액: 효소 표제를 미리 얼음 냉각된 0.1% 소혈청 알부민(BSA)을 포함하는 시약 A의 완충액에 용해시킨다. , 같은 용액으로 0.1〜0.3U/mg로 희석하여 빙냉 보존한다.

4. 절차

1. 하기 반응 혼합물을 큐벳(d=1.0cm)으로 제조 30 ~ 약 5 분간 예비 가온한다.

< td class="w20p">(A)< td class="w20p">(B)< td class="w20p">(C)
2.30mlTris-HCl 완충액
0.50ml포도당 용액
0.10mlATP 솔루션
0.10mlNAD+수용액(D)
0.01mlG-6-PDH 용액(E)

2. 효소 용액을 0.1mg을 첨가하고, 완만하게 혼화 후, 물을 대조에 30℃으로 제어된 분광광도계로, 340nm의 흡광도 변화를 4〜5분간 기록하고 의 초기 직선 부분으로부터 1분당 흡광도 변화를 구한다(ΔOD test).

3. 맹검은 반응 혼합물 ①에 효소 용액 대신에 효소 희석액 (0.1%BSA를 포함하는 시약 A)를 0.1mg을 첨가하고, 상기와 동일한 조작을 행하여 1 분당 흡광도 변화를 구한다. (ΔODblank).

5. 수식

  • U/ml=

  • ΔOD/min (OD test-OD blank)×3.11(mg)×희석 배율

    6.22×1.0×0.1(mg)

< /tr>
= Δ OD/min×5.0×희석 배율
U/mg= U/ml×1/C
6.22: NADH의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm2/micromole)
1.0: 광로 길이(cm)
C: 용해 시 효소 농도(c mg/ml)< /td>

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