진단시약원료 효소

G3O-321

준비 및 사양

성상황색 무정형 분말, 동결건조
활동GradeⅢ 15U/mg-solid 이상
오염물질젖산산화효소≤2.0×10-4%
아데노신 트리포스파타제≤2.0×10-4%
안정제아미노산, 유행

속성

< th align="left">미카엘리스 상수
안정성−20℃에서 안정적 최소 1년 동안(그림 1)
분자량 대략. 67,000(SDS-PAGE 기준)
등전점4.6±0.1
1.3×10-3M
억제제SH- 시약, 이온 세제, 금속 이온 등
최적 pH6.0−7.0( 그림 3)
최적 온도45℃(그림 .4)
pH 안정성4.5−8.5(25℃, 20시간)(그림 5)
열 안정성45℃ 미만 (pH6.5,15분)(그림 6)
다양한 화학물질의 영향(표 1)

응용

이 효소는 지질단백질 리파제(LPL-311, 와 결합하여 트리글리세리드를 효소적으로 측정하는 데 유용합니다. LPL-314) 및 글리세로키나제(GYK-301, GYK-311)를 임상 분석에 사용합니다.

분석

원리

원칙

Principle

퀴노네이민 염료의 외관은 분광광도법으로 555nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 1개 단위는 분당 1마이크로몰의 과산화수소(퀴논이민 염료의 0.5마이크로몰)를 형성합니다.

< /div>

방법

시약

< /tr>
A. D,L-α-글리세로인산염 용액1.5M[D,L-α-글리세로인산염(이나트륨염,MW=324.17) 48.63g을 칭량하여 용해시킨다. 60ml의 H2O에 넣고 25℃에서 pH를 6.5±0.05로 조정한 후; with 4.0N HCl, H2O로 최대 100ml 충전] (0−4℃에서 보관하면 2주 동안 안정함)
B. PIPES-NaOH 완충액, pH 6.50.5M [15.12g의 PIPES(MW=302.36) 무게, 60ml의 H2O에 현탁하고 10N으로 용해 NaOH. 25℃에서 pH를 6.5±0.05로 조정한 후; 10N NaOH로 H2O로 100ml까지 채움](0−4℃에서 보관하면 2주 동안 안정함)
C. 4-AA 용액28mM [569mg 4-아미노안티피린(MW=203.25)/100ml의 H2O](4& #x2103; 갈색병에 들어있음)
D. EHSPT(TOOS) 용액20mM [591mg N-에틸-N-(2-하이드록시-3-설포프로필)-m-톨루이딘(MW=295.3)/100ml H2O](갈색병에 담아 4도에 보관하면 일주일간 안정함)
E. 과산화효소 용액0.05% [과산화효소 50mg(110 퍼푸로갈린 단위/mg)/H2O 100ml(신선하게 준비해야 함)
F. 효소 희석제20mM PIPES-NaOH 완충액, pH 6.5 contg. 0.5M NaCl

절차

1. 다음 작업 용액(40개 테스트)을 갈색 병에 준비하고 ice.test에 보관하세요.

40ml기질 용액(A)
40mlPIPES-NaOH 완충액, pH 6.5(B)
5ml4-AA 솔루션(C)
5mlEHSPT 솔루션(D)
10ml과산화효소 용액(E)
< /thead>< /tr>
분석 혼합물의 농도
PIPES-NaOH 버퍼193mM
NaCl19.2mM
D, L-α-글리세로포스페이트577mM
4-아미노안티피린1.3mM
EHSPT0.96mM
과산화효소약 5.3U/ml

2. 2.5ml의 작업 용액을 큐베토(d=1.0cm)에 피펫으로 넣고 30°2103;에서 평형화합니다. 약 5분 동안.

3. 효소 용액* 0.1ml를 넣고 가볍게 뒤집어 섞으세요.

4. 30°로 온도가 조절된 분광 광도계에서 3~4분 동안 물에 대해 555nm에서 광학 밀도의 증가를 기록하고 곡선의 초기 선형 부분에서 분당 OD를 계산합니다(&# x394;OD 테스트).

동시에 ΔOD 테스트와 동일한 방법을 사용하여 공백율(ΔOD 공백)을 측정합니다. 효소 용액 대신 효소 희석제가 추가됩니다.

*효소 제제를 얼음처럼 차가운 효소 희석제(F)에 녹입니다. ), 동일한 완충액으로 0.05−0.2U/ml로 희석하여 얼음 위에 보관하세요.

계산

활동량은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다:

  • 활동량(U/ml) ) =

  • ΔOD/min (ΔOD 테스트−ΔOD 공백)×Vt ×df

    29.9×1/2×1.0×Vs

  • = ΔOD/min×1.739×df

체중 활성도(U/mg) = (U/ml)×1/C< /p>

< /tbody>
Vt: 총 용량(2.6ml)
Vs: 샘플량(0.1ml)
29.9: 분석 조건에서 퀴노네이민 염료의 밀리몰 흡광 계수(cm2/마이크로몰)
1/2: H2O2 1몰이 퀴논이민 염료 0.5몰을 생성한다는 사실에 근거한 인수
1.0: 빛의 경로 길이(cm)
df : 희석 인자
C: 용해 시 효소 농도(c mg/ml)

표 1. Effect of Various Chemicals on L-α-Glycerophosphate oxidase

[The enzyme dissolved in 0.1M PIPES-NaOH buffer, pH7.0 (10U/ml) was incubated at 25& #x2103; for 1hr.]

  • < th align="center" class="w20p">Chemical< td>FeSO4
    Concn.(mM)Residual
    activity(%)
    None- 100
    Metal salt
    Metal salt2.0
    MgCl2100.0
    CaCl296.5
    BaCl299.5
    67.4
    FeCl3< /td>73.1
    CoCl299.5
    MnCl2100.1
    ZnSO496.4
    NiCl297.9
    AgNO3 93.1
    CuSO484.7
    MIA2.098.4
    NaF2.0 99.4
  • < td>101.8
    ChemicalConcn. (mM)Residual
    activity(%)
    NaN3 20100.2
    EDTA5099.6
    o-Phenanthroline2.0101.6
    α,& #x3B1;′-Dipyridyl2.0100.0
    Borate20
    IAA2.098.7
    NEM< /td>2.099.8
    Hydroxylamine2.0100
    Triton X-1000.10%110.6
    Brij 350.10%108.9
    Tween 200.10%99.1
    Span 200.10%103.7
    Na-cholate0.10%105.8
    SDS0.05%3.0
    DAC0.05%71.8

MIA, Monoiodoacetate; EDTA, Ethylenediaminetetraacetate; IAA, Iodoacetamido;

NEM, N-Ethylmaleimide; SDS, Sodium sulfate; DAC, Dimethylbenzylalkylammonium chloride.

  • 1. Stability (Powder form)

    Fig.1. Stability (Powder form)

    (Kept under dry form)

  • Fig.2. Stability (Powder form)

    Fig.2. Stability (Powder form)

    (Kept under dry form)

  • Fig.3. pH-Activity

    Fig.3. pH-Activity

    0.1M buffer solution:pH5.0-6.5 ,MES; pH6.5-7.5,PIPES-NaOH;7.5-9.0,Tris-HCl

  • Fig.4. Temperature activity

    Fig.4. Temperature activity

    (in 0.2M PIPES-NaOH buffer,pH6.5)

  • Fig.5. pH-Stability

    Fig.5. pH-Stability

    25℃,20hr-treatment with 0.1M buffer solution; pH4.5-6.0,acetate;pH6.0-8.0,K-phosphate; pH8.0-9.0,Tris-HClenzyme concn.:20U/ml,< /p>

  • Fig.6. Thermal stability

    Fig.6. Thermal stability

    15min-treatment with 0.1M PIPES-NaOH buffer,pH6.5, enzyme concn.:20U/ml

활성 측정법(Japanese)

1 원리

원리

2O2의 양을 정량한다.

2. 정의

하기 조건 하에서 1분 동안 1 마이크로몰 H2O2를 생성하는 효소량을 1단위(U)로 한다.

3. 시약

  • 1.5M 글리세로포스페이트 용액 [48.63g의 D,L-α글리세로포스페이트 · 2Na (MW = 324.17)를 약 60ml의 증류수에 용해시킨 후, 4.0N HCl로 pH를 6.5 ± 0.05로 조정 (25 & # x2103;)하고 증류수로 100ml로한다. ](0〜4℃보존으로 2주간은 사용 가능)
  • 0.5M PIPES-NaOH 완충액,pH6.5[15.12g의 PIPES(MW=302.36)를 약 60ml의 증류수로 용해하면서, 10N NaOH로 pH를 6.5±0.05로 조정(25℃)하고, 증류수로 100ml로 한다. ] (0 & # x301C; 4 & # x2103; 보관에서 2 주간 사용 가능)
  • 28mM 4-AA 수용액 [569mg의 4- 아미노 안티 피린 (MW = 203.25)을 100ml의 증류수에 용해시킨다. . ](갈색병 중 4℃ 보존으로 1주일 사용 가능)
  • 20mM EHSPT(TOOS) 수용액 [591mg의 EHSPT(MW=295.3)를 100ml의 증류수에 용해한다. (갈색 병에서 4 & # x2103; 보존에 1 주일 사용 가능)
  • POD 용액 [50mg의 퍼 옥시다아제 (POD) (110 풀 프로 갈린 단위 / mg)를 100ml의 증류수에 용해시킨다. ] (갈색 병에서 4℃ 보존)(용시 제조)

효소 용액: 효소 표품을 미리 빙냉한 0.5M NaCl 함유 20mM PIPES -NaOH 완충액, pH 6.5에서 용해 (약 1mg / ml)하고 분석 직전에 동일한 완충액으로 0.05 & # x301C; 0.20U / ml로 희석한다.

4. 절차

1. 하기 반응 혼합물을 제조한다. (갈색 병에서 얼음 냉각 저장)

40ml기질 용액 (A)
40ml완충액< /td>(B)
5ml4-AA 수용액 (C)
5mlEHSPT 수용액< /td>(D)
10mlPOD 수용액(E)

2.반응 혼합 2.5 ml를 큐벳 (d = 1.0cm)에 넣고 30 °에서 약 5 분간 예비 가온한다.

3. 효소 용액 0.1ml를 첨가하고, 완만하게 혼화 후, 물을 대조에 30℃으로 제어된 분광 광도계 에서 555nm의 흡광도 변화를 3ĭC;4분간 기록하고, 그 초기 직선 부분으로부터 1분간 당의 흡광도 변화를 구한다(ΔODtest).

4. 맹검은 반응 혼합물 ①에 효소 용액 대신에 효소 희석액 (0.5M NaCl 포함 20mM PIPES-NaOH 완충 액, pH 6.5) 0.10ml를 첨가하고, 상기와 같이 조작을 행하여, 1분간 당의 흡광도 변화를 구한다(ΔODblank).

5. 수식

  • U/ml=

  • ΔOD/min (ΔOD test−ΔOD blank)×2.60(ml)× 희석 배율

    29.9×1/2×1.0×0.1

= ΔOD/min×1.739×희석 배율
U/mg= U/ml ×1/C
29.9: Quinoneimine 염료의 상기 측정 조건 하에서 밀리몰 분자 흡광 계수(cm2 /micromole)
1/2: 효소 반응에서 생성된 H2O21분자로 형성되는 Quinoneimine 색소는 1/2분자인 것에 의한 계수
C: 용해시 효소 농도(c mg/ml)

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