HOME준비 및 사양
| 외관 | 백색 무정형 분말, 동결건조 | |
|---|---|---|
| 활동 | GradeⅢ 30U/mg-solid 이상 | |
| 오염물질 | 카탈라제 | ≤1.0×10-1% |
| NADH 산화효소 | ≤1.0×10-3% | |
| 아데노신 트리포스파타제 | & #x2264;1.0×10-3% | |
속성
| 안정성 | −20℃에서 안정적 최소 1년 동안 (그림 1) |
|---|---|
| 분자량 | 대략. 220,000(겔 여과 기준) |
| 구조 | 약 4개의 하위 단위. 58,000 |
| 등전점 | 4.3 |
| 미카엘리스 상수 | 9.4×10-5M(글리세롤), 1.3×10-5M(ATP), 2.1×10-3 M(디하이드록시아세톤) |
| 억제제 | p-클로로머쿠리벤조에이트, Hg＋＋, Ag + |
| 최적 pH | 10.0 (그림 2) |
| 최적 온도 | 70℃ (그림 3) |
| pH 안정성 | pH 5.5−10.0 ( 25℃, 20시간) (그림 4) |
| 열 안정성 | < td>65℃ 미만 (pH 7.5, 30분) (그림 5)|
| 기질 특이성 | (표 1) |
| 다양한 화학물질의 영향 | (표 2) |
애플리케이션
이 효소는 글리세롤-3-포스페이트 산화효소(=G-3-P 산화효소, G3O-321) 또는 피루베이트 키나제 및 젖산염 탈수소효소(< u>LCD-209, LCD-211, LCD-221), 지질단백질 리파제(LPL-311, LPL-314) 임상 분석.
분석
원칙
퀴노네이민 염료의 외관은 분광광도법으로 500nm에서 측정됩니다.
단위 정의
아래 설명된 조건에서 1개 단위는 분당 1마이크로몰의 과산화수소(퀴논이민 염료의 0.5마이크로몰)를 형성합니다.
< /div>방법
시약
| A. 글리세롤 용액 | 0.3M(신선하게 준비해야 함) | |
|---|---|---|
| B. 4-AA 용액 | 0.1%(4-아미노안티피린 100mg / H2O 100ml) | |
| 0.1%(페놀 100mg / H2O 100ml) | ||
| 디. 퍼옥시다제 용액 | 퍼옥시다제 20mg(110 퍼푸로갈린 단위/mg)/H2O | |
| 마. G-3-POD 용액 | 20U/ml(200mM HEPES 완충액, pH 7.9에 용해) | |
| F. 완충 용액 | 200mM HEPES, pH 7.9 contg. 20mM MgCl2 및 40mM ATP(새로 준비해야 함) | |
| G. 효소 희석제 | 20mM K-인산염 완충액, pH 7.5 | |
절차
1. 다음 작업 용액을 갈색 병에 준비하고 얼음 위에 보관하세요.
| 10ml | < td class="w30p">4-AA 솔루션(B) | |
| 20ml | 페놀 용액 | (C) |
| 20ml | < td class="w30p">과산화효소 용액(D) | |
| 40ml | G-3-POD 솔루션 | (E) |
| 10ml | 버퍼 솔루션 | (F) |
| 분석 혼합물의 농도 | |
|---|---|
| HEPES 버퍼 | 95.2mM |
| 글리세롤 | 4.76mM |
| ATP | 3.81mM |
| MgCl2 | 1.90mM | < /tr>
| 4-AA | 0.469mM |
| 페놀 | 2.02 mM |
| 과산화효소 | ca.5.2 U/ml |
| G-3-POD | 약 7.6U/ml | < /tr>
2. 큐벳에 작업 용액 3.0ml를 피펫으로 넣습니다(d=1.0cm).
3. 효소 용액 0.1ml를 첨가*하고, 가볍게 뒤집어 혼합하고 37℃에서 평형화합니다. 약 5분 동안.
4. 글리세롤 용액(A) 0.05ml를 넣고 가볍게 뒤집어 섞어주세요.
5. 37°로 온도 조절된 분광 광도계에서 물에 대해 500nm에서 광학 밀도를 3~4분 동안 기록하고 곡선의 초기 부분에서 분당 OD를 계산합니다(OD 테스트). ).
동시에 효소용액 대신 효소희석액을 첨가하는 것을 제외하고는 시험과 동일한 방법으로 바탕율(ΔOD 공백)을 측정한다.< /p>
*효소 제제를 얼음처럼 차가운 효소 희석제(G)에 녹이고 다음 용액으로 0.2−0.4U/ml로 희석합니다. 동일한 버퍼, 분석 직전.
계산
활동은 다음을 통해 계산할 수 있습니다. 다음 공식을 사용합니다:
부피 활동(U/ml) =
< li class="txtCenter">= ΔOD/min×4.74× df
ΔOD/min (ΔOD/min (OD 테스트−OD 공백)×Vt×df
13.3×1/2×1.0×Vs
체중 활동도(U/mg) = (U/ml)×1/C
| Vt | : 총 용량(3.15ml) |
| Vs< /td> | : 샘플량(0.1ml) |
| 13.3 | : 분석 중인 퀴논이민 염료의 밀리몰 흡광 계수 조건(제곱센티미터/마이크로몰) |
| 1/2 | : H2O2 1몰이 0.5몰을 생성한다는 사실에 기초한 인수 퀴논이민 염료 |
| 1.0 | : 빛의 경로 길이(cm) |
| df | : 희석 인자 |
| C | : 용해 시 효소 농도( c mg/ml) |
참조
1) H.-S.Huang, T.Yoshida, Y.Meng, T.Kabashima, K.Ito, Y.Nishiya, Y.Kawamura 및 T.요시모토; J.Ferment.Bioeng., 83, 328 (1997).
표 1. 글리세롤 키나제의 기질 특이성
[50mM HEPES 완충액을 포함한 피루브산 키나제-락테이트 탈수소효소 시스템, pH 7.9]
기판(4.5mM) 상대 활성(% ) 글리세롤 100 글리세롤-α ;-모노클로로히드린 0.1 에틸렌 글리콜 - 1 ,2-프로판디올 - 1,3-프로판디올 0.2 1,3-부탄디올 - 1,4-부탄디올 0.1 기판(4.5mM) 상대 활성(%) 2,3-부탄디올 0.2 D-만니톨 - D-소르비톨 - D-글루코스 - 리비톨 - 메탄올 - 에탄올 - Chemical Concn.(mM) Residual
activity(%)None - 100 Metal salt < /td> MgCl2 1.0 100 CaCl2 102 Ba(OAc)2 < /td> 101 FeSO4 98 FeCl3 89 CoCl2 104 MnCl2< /td> 99 ZnCl2< /td> 103 Cd(OAc) 2 101 NiCl 2 98 CuSO4 99 Pb(OAc)2 100 AgNO3 10 < /tr>HgCl2 2 Dithiothreitol 1.0 100 PCMB 1.0 0 Chemical Concn.(mM) Residual
activity(%)MIA 1.0 101 NaF 1.0 100 NaN3 1.0 106 EDTA 5.0 100 o-Phenanthroline 1.0 102 α,α′-Dipyridyl 1.0 101 Borate 50 103 IAA 1.0 99 NEM 1.0 100 Hydroxylamine 1.0 99 Triton X-100 1.0% 103 Brij 35 0.1% 104 Tween 20 0.1% 103 Span 20 0.1% 102 Na-cholate 0.5% 105 < /tr>SDS 0.5% 1 DAC 0.5% 84 Fig.1. Stability (Powder form)
(kept under dry conditions)
Fig.2. pH-Activity
37℃ 10min-reaction in 45mM buffer solution: pH5.2-6.7,MES:pH6.6-7.7,HEPES; pH7.5-8.7,TAPS;pH8.5-9.6,CHES; pH8.7-11.2,Glycine-NaOH
Fig. 3. Temperature activity
(10min-reaction in 45mM HEPES buffer,pH7.9)
Fig.4. pH-Stability
enzyme concn. ca.300U/ml 25℃ 20hr-treatment in 50mM buffer solution: pH5.6-7.1,MES;pH7.1-8.0,HEPES;pH8.0-9.0, TAPS;pH9. 0-10.0,CHES
Fig.5. Thermalstability
enzyme concn. ca.300U/ml 30min-treatment with 20mM K-phosphate buffer, pH7.5
>
표 2. Effect of Various Chemicals on Glycerol kinase
[The enzyme dissolved in 20mM K-phosphate buffer, pH 7.5 (100U/ml) was incubated with each chemical at 25 ]
Ac, CH3CO; PCMB, p-Chloromercuribenzoate; MIA, Monoiodoacetate; EDTA , Ethylenediaminetetraacetate; IAA, Iodoacetamide; NEM, N-Ethylmaleimide; SDS, Sodium dodecyl sulfate; DAC, Dimethylbenzylalkylammonium chloride.
활성 측정법(Korean)
1. 원리
2. 정의
하기 조건 하에서 1분에 1 마이크로몰의 H2O2를 생성하는 효소량을 1단위(U) 한다.
3. 시약
- 0.3M 글리세롤 용액(사용시 제조)
- 4-AA 용액, 0.1 % (100mg의 4- 아미노 안티 피린을 100ml의 증류수에 용해시킨다)
- 페놀 용액, 0.1 % (100mg의 페놀을 100ml의 증류수에 용해시킨다. >
- 퍼옥시다아제 용액 [25 mg의 퍼옥시다아제(110 풀 프로갈린 단위/mg)를 약 100 ml의 증류수로 용해시킨다.]
- G-3-POD 용액, 20 U/ml(200 mM HEPES 완충액 , pH 7.9에서 용해 될 것.)
- 완충액 (20 mM MgCl2 및 40 mM ATP를 함유하는 200 mM HEPES 완충액, pH 7.9) (사용시 제조)
효소 용액: 효소 표제를 미리 빙냉한 20mM K 인산 완충액, pH7.5로 분석 직전에 0.2〜0.4U/ml로 희석한다.
4. 절차
1. 얼음 냉각 저장).
| 10ml | 4-AA 솔루션 | (B) |
| 20ml | 페놀 용액 | (C) |
| 20ml | 퍼옥시다아제 용액 | (D) |
| 40ml | G-3-POD 용액 | (E) |
| 10ml | 완충액 | (F) |
2. 상기 반응 혼합물을 큐벳(d= 1cm)에 3.0ml 채취하고, 효소액 0.1ml를 첨가하고, 완만하게 혼화 후, 37℃로 약 5분간 예비 가온한다.
3.글리세롤 용액(A) 0.05ml를 첨가하고, 완만하게 혼화 후, 물을 대조에 37℃로 제어되었다 분광광도계로 500nm의 흡광도 변화를 3ĭC;4분간 기록하고, 그 초기 직선 부분으로부터 1분간당의 흡광도 변화를 구한다(ΔODtest).
4. 맹검은 반응 혼합액으로 효소 용액 대신 효소 희석액 (20 mM K 인산염 완충액, pH 7). 5)를 0.1ml 첨가하고, 상기와 같이 조작하여 1 분당 흡광도 변화를 구한다 (ΔODblank).
5. 수식
U/ml=
ΔOD/min (OD test-OD blank)×3.15(ml)×희석 배율
13.3×1/2×1.0×0.1(ml)
| = ΔOD/min×4.74×희석 배율 | |||
| U/mg | = U/ml×1/C< /td> | ||
| 13.3 | : Quinoneimine 염료의 상기 측정 조건 하에서 밀리몰 분자 흡광 계수(cm2/micromole) | ||
| 1/2 | : 효소 반응에서 생성된 H2O21 분자로부터 형성 하는 Quinoneimine 염료는 1/2 분자인 것에 의한 계수 tr> | C | : 용해 시 효소 농도(c mg/ml) |
트위터 바로가기