TOYOBO BIO

진단시약원료 효소

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준비 및 사양

< tbody>< th align="left" rowspan="3">오염물질

외관	백색 무정형 분말, 동결건조
활동성	GradeIII 20U/mg-solid 이상 (안정제 약 50% 함유)
NADH 산화효소	≤1.0×10^-2%
카탈라제	≤1.0×10^-1%
포스파타제 (pH 6.0)	≤2.0×10^-3%

속성

안정성	−20℃에서 안정적 최소 1년 동안(그림 1)
분자량	대략. 128,000(겔 여과 기준)
등전점	4.2
미카엘리스 상수	4.4×10^-5M(글리세롤), 4.3×10^-4M(ATP)
억제제	p-클로로머쿠리벤조에이트, 중금속 이온(Pb⁺⁺, Fe⁺⁺ , Hg^＋＋, Ag^＋)
최적 pH	9.8 (G-3-PDH 시스템), 7.8 (G-3-P 산화효소 시스템)(그림 4)
최적 온도	50℃(그림 5)
pH 안정성	pH 5.5−10.0(25℃, 20시간)(그림 6)
열 안정성	40℃ 미만 (pH 7.5, 15분)(그림 7)
기질 특이성	이 효소는 ATP의 말단 인산 부분이 글리세롤의 1차 수산기 중 하나로 입체특이적 전달을 촉진하여 sn-글리세롤-3-P를 형성합니다. 이 효소는 글리세롤에 대한 특이성이 가장 높으며 디하이드록시아세톤과 글리세르알데히드를 인산화합니다(표 1,2). 반응에는 Mg^＋＋가 필수적으로 필요합니다.
다양한 화학물질의 영향	(표 3)

적용

이 효소는 글리세롤-3-포스페이트 산화효소(=G-3-P 산화효소, G3O-321G3O-321) 또는 피루베이트 키나제 및 젖산 탈수소효소(LCD-209, LCD-211, LCD-221), 지질단백질 리파제( LPL-311, LPL-314) 임상 분석.

분석

원칙

NADH의 모양은 분광 광도법으로 340nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 1개 단위는 분당 1마이크로몰의 NADH를 형성합니다.

방법

시약

아. 글리신-히드라진 완충액, pH 9.8	0.2M［글리신 1.5g과 히드라진 수화물 20.8g(MW=50.06)을 달아 H_{2O에 1.0M MgCl₂ 0.4ml를 넣고 2.0N HCl 또는 2.0N KOH로 pH를 9.8로 맞춘 후 H₂O를 100ml까지 채운다. ]}
B. 글리세롤 용액	0.1M(신선하게 준비해야 함)
다. ATP 용액	0.1M(신선하게 준비해야 함)
D. NAD+ 용액	14mM(신선하게 준비해야 함)
E. 글리세롤-3-포스페이트 탈수소효소(G-3-PDH) 용액	3.2M 황산암모늄 용액의 결정 현탁액(10mg/ml, 약 60U/mg, Roche 제품) td>
F. 효소 희석제	0.2% BSA를 함유한 20mM K-인산염 완충액 pH 7.5

절차

1. 다음 반응 혼합물을 큐벳(d=1.0cm)에 준비하고 25°C에서 평형화합니다. 약 5분 동안.

3.0 ml	0.2M 글리신- 히드라진 완충액, pH 9.8	(A)
0.10ml	기질 용액	(B)
0.05ml	ATP 솔루션	(C)
0.10ml	NAD+ 용액	(D)
0.03ml	G-3-PDH 용액	(E)

< /thead>

분석 혼합물의 농도
글리신 버퍼	0.18M
글리세롤	3.0 mM
ATP	1.5 mM
NAD⁺	0.42mM
MgCl₂	3.6mM
G-3-P DH	ca.5.4 U/ml

2. 효소액 0.05ml^*를 넣고 가볍게 뒤집어 섞어주세요.

3. 25℃로 온도가 조절된 분광 광도계에서 3~4분간 물에 대해 340nm에서 광학 밀도의 증가를 기록합니다. 곡선의 초기 선형 부분에서 분당 OD를 계산합니다(OD 테스트).

동시에 블랭크 비율(Δ #x394;OD 공백) 효소용액 대신 효소희석액을 첨가하는 것을 제외하고는 시험과 동일한 방법을 사용하였다.

^*효소 제제를 얼음처럼 차가운 효소 희석제(F)에 녹이고 동일한 완충액으로 0.2−0.4U/ml로 희석한 후 얼음 위에 보관합니다.

계산

활동은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다:

볼륨 활동(U/ml) =
ΔOD/min (ΔOD 테스트−ΔOD 공백)×Vt×df
6.22×1.0×Vs
= ΔOD/min×10.7×df

웨이트 활동(U/ mg) = (U/ml)×1/C

Vt	: 총 부피( 3.33ml)
Vs	: 샘플량(0.05ml)
6.22	: NADH의 밀리몰 흡광계수(cm²/마이크로몰)
1.0	: 광선 길이(cm)
df	: 희석 계수
C	: 용해 시 효소 농도(c mg/ml)

참조

1) 방법 효소 분석, vol. 1, p.468(HUBergmeyer 편집, 영어 제2판), Verlag Chemie Weinheim & Academic Press, New York-London(1974).

2) S.Hayashi 및 ECCLin. ; J.Biol.Chem., 212, 1030 (1967).

표 1. 글리세롤 키나제(피루베이트 키나제-락테이트 탈수소효소 시스템)의 기질 특이성²⁾, pH 7.5)

[50mM HEPES 완충액을 사용한 피루브산 키나제-젖산 탈수소효소 시스템, pH 7.9]

기판(6mM) 상대활성도(%)
글리세롤 100
글리세롤-α-모노클로로히드린 0.09
에틸렌 글리콜 -
1,2-프로판디올 -
1,3-프로판디올 0.07
1,3-부탄디올 -
1,4- 부탄디올 -
< /tr>< /tr>
기판(6mM) 상대활성도(%)
2,3-부탄디올 -
D-만니톨 -
D-소르비톨 -
D-글루코스 -
리비톨 -
메탄올 -
에탄올 -

기판(6mM)	상대활성도(%)
글리세롤	100
글리세롤-α-모노클로로히드린	0.09
에틸렌 글리콜	-
1,2-프로판디올	-
1,3-프로판디올	0.07
1,3-부탄디올	-
1,4- 부탄디올	-

기판(6mM)	상대활성도(%)
2,3-부탄디올	-
D-만니톨	-
D-소르비톨	-
D-글루코스	-
리비톨	-
메탄올	-
에탄올	-

-, 감지되지 않음

표 2. Values of Km and Vmax for Various Substrate (Pyruvate kinase-Lactate dehydrogenase system²⁾, pH 7.5)

Substrate Km(M) Vmax(Relative value)
Glycerol 4.4×10< sup>-5* 100
Dihydroxyacetone 6.0×10^-3 152
D, L-Glyceraldehyde 5.8×10^-3 76

Substrate	Km(M)	Vmax(Relative value)
Glycerol	4.4×10< sup>-5*	100
Dihydroxyacetone	6.0×10^-3	152
D, L-Glyceraldehyde	5.8×10^-3	76

^*This value was taken from that determined by G-3-PDH system, pH 9.8.

Table 3. Effect of Various Chemicals on Glycerol kinase

[The enzyme dissolved in 0.1M acetate buffer, pH 6.0 (40U/ml) was incubated at 30℃ for 1hr with each chemical.]

< td align="left">98< td align="left">
Chemical Concrn .(mM) Residual
activity(%)
None - 100
Metal salt 2.0
MgCl₂ 100
CaCl₂ 100
Ba(OAc)₂ 100
FeCl₃ 75
CoCl₂ 100
MnCl₂ 100< /td>
Zn(OAc)₂ 99
NiCl₂
CuSO₄ 100
Pb(OAc)₂ 88
AgNO₃ 0
HgCl₂ 0
< td align="left">EDTA
Chemical Concrn.(mM) Residual
activity(%)
PCMB 2.0 22
MIA 2.0 96
NaF 2.0 97

NaN3 20 97
5.0 101
o-Phenanthroline 2.0 96
α,α′-Dipyridyl 2.0 92
Borate 50 100
Triton X -100 0.1% 99
Na- cholate 0.1% 97

Chemical	Concrn .(mM)	Residual activity(%)
None	-	100
Metal salt	2.0
MgCl₂		100
CaCl₂		100
Ba(OAc)₂		100
FeCl₃		75
CoCl₂		100
MnCl₂		100< /td>
Zn(OAc)₂		99
NiCl₂
CuSO₄		100
Pb(OAc)₂		88
AgNO₃	0
HgCl₂		0

Chemical	Concrn.(mM)	Residual activity(%)
PCMB	2.0	22
MIA	2.0	96
NaF	2.0	97
NaN3	20	97
5.0	101
o-Phenanthroline	2.0	96
α,α′-Dipyridyl	2.0	92
Borate	50	100
Triton X -100	0.1%	99
Na- cholate	0.1%	97

Ac, CH₃CO; PCMB, p-Chloromercuribenzoate; MIA, Monoiodoacetate.

Fig.1. Stability (Powder form)
(kept under dry conditions)
Fig.2. Stability (Powder form)

(kept under dry conditions)
Fig.3. Stability (Liquid form at 37℃)
(enzyme concetration: 400-500 U/ml buffer composition:50mM K-phosphate buffer, contg. 3.2M ammonium sulfate, pH6.3)
Fig.4. pH-Activity
(25℃; G-3-PDH system(○̶̶○,0.18M glycine-hydrazine buffer); G-3-P oxidasesystem (●̶̶● ,50mM Tris-HCI butfer; △̶̶△,50mM(2-N-Morpholino)ethanesulfonic acid-NaOH buffer.))
< /p>
Fig.5. Temperature activity
(in 0.18M glycine-hydrazine buffer, pH9.8)
Fig.6 pH-Stability
(25℃; 20hr-treatment with 50mM buffer solution: pH4.0-6.0, acetate; pH6.0-9.0, K-phosphate; pH9. 0-11.0,K₂CO₃-NaHCO₃)
< p class="img imgAuto">
Fig.7. Thermal stability
(15min-treatment with 50mM K-phosphate buffer, pH7.5)

활성 측정법(Japanese)

1. 원리

2. 정의

하기 조건 하에서 1분에 1 마이크로몰의 NADH를 생성하는 효소량을 1단위 (U) 한다.

3. 시약

0.2M 글리신-히드라진 완충액, pH 9.8(글리신 1.5g 및 히드라진(포함) 물) 20.8g을 증류수 80ml에 용해시킨 후, 1.0M MgCl ₂ 0.4ml를 첨가하고, 2N HCl 또는 2N KOH로 pH를 9.8로 조정 한 후, 최종 액량을 증류수로 100ml 한다)
0.1M 글리세롤 수용액(용시 조제)
0.1M ATP 수용액(용시 조제)
14mM NAD^{+수용액(용시 조제)}
글리세롤-3-인산 탈수소 효소(G-3-PDH) 용액 [Roche제 황안 현탁 결정 효소 (10mg/ml, 약 60U/mg) ]

효소 용액: 효소 표품을 미리 빙냉한 0.2%BSA를 포함하는 20mM K-인산 완충액, pH 7.5에서 용해하고, 같은 완충액 에서 0.2〜0.4U/ml로 희석하고 얼음 냉각 저장.

4. 절차

1. 하기 반응 혼합물을 큐벳(d=1.0cm)으로 제조 25℃에서 약 5분간 예비 가온

< td class="w30p">기질 용액< td class="w30p">ATP 수용액< td class="w30p">NAD+ 수용액< td class="w30p">G-3-PDH 용액

3.0ml	글리신-히드라진 완충액	(A)
0.10ml	(B)
0.05ml	(C)
0.10ml	(D)
0.03ml	(E)

2. 효소 용액 0.05ml를 첨가하고, 완만하게 혼합한 후, 물을 대조에 25℃로 제어된 분광광도계로 340nm의 흡광도 변화를 3〜 4 분 동안 기록하고 초기 직선 부분에서 분당 흡광도 변화를 찾습니다 (ΔOD test).

3. 맹검은 반응 혼합액으로 효소 용액 대신에 효소 희석액(20mM K-인산 완충액, pH 7.5)를 0.05ml 첨가하고, 상기와 같이 조작을 행하여, 1분간 당의 흡광도 변화를 구한다(ΔODblank).

5. 수식

U/ml=
ΔOD/min (ΔOD test−ΔOD blank)×3.33(ml)× 희석 배율
6.22×1.0×0.05(ml)

< /tr>

	= ΔOD/min×10.7×희석 배율
U/mg	= U/ml× 1/C
6.22	: NADH의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm²/micromole)
1.0	: 광로 길이(cm)
C	: 용해 시 효소 농도 (c mg/ml)