TOYOBO BIO

진단시약원료 효소

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준비 및 사양

< tbody>< th align="left">오염물질< tr>

성상	백색 무정형 분말, 동결건조
활동성	GradeⅢ 50U/mg-고체 이상 (안정제 약 50% 함유)
NADH 산화효소	≤1.0×10^-3%
안정 장치	BSA

< /div>

속성

< tr>

안정성	−20℃에서 안정적 최소 6개월 동안(그림 1)
분자량	대략. 390,000
등전점	4.4±0.1
미카엘리스 상수	1.1×10^-2M(글리세롤), 8.9×10^-5M(NAD+)
구조	효소 분자당 10개의 하위 단위(42,000)
억제제	p-클로로머쿠리벤조에이트, o-페난트롤린, 모노요오도아세테이트, 중금속 이온(Co⁺⁺, Ni⁺⁺, Cu^{++, Zn⁺⁺, Cd⁺⁺)}
최적 pH	10.0−10.5(그림 4)
최적 온도	50&# x2103;(그림 5)
pH 안정성	pH 7.5− 10.5(25℃, 20시간)(그림 6)
열 안정성	55 이하℃ (pH 7.5, 15분)(그림 7)
기질 특이성	이 효소는 글리세롤과 1,2-프로판디올에 대한 특이성이 가장 높으며 글리세롤-β-모노클로로히드린, 에틸렌 글리콜 및 2,3-부탄디올도 산화합니다(표 1). 산화 반응은 K^＋, NH,＋4 및 Rb^＋.
다양한 화학물질의 영향	(표 2 )

응용 분야

이 효소는 지질단백질 리파제(LPL-311, LPL-314<와 결합 시 글리세롤 및 트리글리세리드의 효소 측정에 유용합니다. /u>) 임상 분석에서. ^1,2)

분석

< h2 class="ttl_box">원칙

NADH의 모양은 분광 광도법으로 340nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 1개 단위는 분당 1마이크로몰의 NADH를 형성합니다.

방법

시약

아. 탄산수소 완충액, pH 11.0	0.2M(0.2M K₂CO₃ 및 0.2M NaHCO3 pH 11.0에 도달).
B. 글리세롤 용액	0.3M
다. 황산암모늄 용액	1.0M
D. NAD^＋ 용액	10mM(H₂에 용해)(신선하게 준비해야 함)
E. 효소 희석제	20mM K-인산염 완충액 pH 7.5.

절차

1. 사용 직전에 다음 작업 용액을 준비하세요.

30.0ml	탄산염-중탄산염 완충액, pH 11.0	(A)
22.0ml	기질 용액	(B)
2.0ml	황산암모늄 용액	(C)
6.0ml	NAD⁺ 솔루션	(D)

분석 혼합물의 농도
탄산 완충액	0.10M
글리세로	0.10M
NAD⁺	1.0mM
황산암모늄	33mM

pH가 범위 내에 있는지 확인하세요. (pH 10.0-10.5). 그렇지 않은 경우 1.0N KOH 또는 1.0N HCl을 사용하여 pH를 10.5로 조정하고 갈색 병에 얼음 위에 보관합니다.

2. 작업 용액 2.9ml를 큐벳(d=1.0cm)에 피펫팅하여 25°C에서 평형화합니다. 약 5분 동안.

3. 효소용액 0.1ml^*를 넣고 가볍게 뒤집어 섞어주세요.

4. 25℃로 온도가 조절된 분광 광도계에서 3~4분간 물에 대해 340nm에서 광학 밀도의 증가를 기록합니다. 곡선의 초기 선형 부분에서 분당 OD를 계산합니다(OD 테스트).

동시에 블랭크 비율(&# x394;OD 공백) 효소 용액 대신 효소희석액을 첨가하는 것을 제외하고는 시험과 동일한 방법을 사용하였다.

^*< /span>효소 제제를 얼음처럼 차가운 효소 희석제(E)에 녹이고 동일한 완충액으로 0.10−0.25U/ml로 희석한 후 얼음 위에 보관합니다.

계산

활동은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다:

볼륨 활동(U/ml) =
ΔOD/분(& #x394;OD 테스트−ΔOD 공백)×Vt×df
6.22×1.0×Vs
= ΔOD/min×4.82×df

체중 활동(U/mg) = (U/ml)×1/C

< /tr>

Vt	: 총 용량(3.0ml) )
Vs	: 샘플량(0.1ml)
6.22	: NADH의 밀리몰 흡광계수(cm²/마이크로몰)
1.0	: 광선 길이(cm)
df	: 희석 계수
C	: 용해시 효소 농도(c mg/ml)

< /div>

참조

1) T.Nishina; Rinsho Kensa(일본어), 22, 1304 (1978).

2) M.Sugiura, et al. ; Clin, Chim.Acta, 81, 125(1977).

3) RMBurton; Methods in Enzymology, vol.1, p.397(SPColowick & NOKaplan eds.), Academic Press, New York−London(1955).

표 1. 글리세롤 탈수소효소의 기질 특이성

[50mM HEPES 완충액, pH 7.9를 사용한 피루베이트 키나제-락테이트 탈수소효소 시스템]

td>
기재 상대 활성도(%)
글리세롤 100
글리세롤-α-모노클로로히드린 48.5
에틸렌 글리콜 7.8
1,2-프로판디올 132
1,3-프로판디올 -
1,3-부탄디올 -
1,4-부탄디올 -
기판 상대활성도(%)
2,3-부탄디올 52.6
자일리톨 -
D-만니톨 -
D-글루코스 -
메탄올 -
에탄올 -

기재	상대 활성도(%)
글리세롤	100
글리세롤-α-모노클로로히드린	48.5
에틸렌 글리콜	7.8
1,2-프로판디올	132
1,3-프로판디올	-
1,3-부탄디올	-
1,4-부탄디올	-

기판	상대활성도(%)
2,3-부탄디올	52.6
자일리톨	-
D-만니톨	-
D-글루코스	-
메탄올	-
에탄올	-

-, 감지되지 않음 p>

표 2. Effect of Various Chemicals on Glycerol dehydrogenase

< th align="center" class="w20p">Chemical
Concn.(mM) Residual
activity(%)
None - 100
Metal salt 1.0
MgCl₂ < /td> 100
CaCl₂ 97
SrCl₂ 98
BaCl₂ 95
MnCl₂< /td> 94
CoCl₂ 57
NiCl₂ 50
CuSO ₄ 2.4
ZnCl₂ 1.5
CdCl₂ 11
< tr>< td align="left">101
Chemical Concn.(mM) Residual
activity(%)
PCMB 0.1 25
MIA 1.0< /td> 78
NaN₃ 1.0 110
NaF 1.0< /td> 108
EDTA 1.0
KCN 1.0 94
o-Phenanthroline 1.0 13

Concn.(mM)	Residual activity(%)
None	-	100
Metal salt	1.0
MgCl₂	< /td>	100
CaCl₂		97
SrCl₂		98
BaCl₂		95
MnCl₂< /td>		94
CoCl₂		57
NiCl₂		50
CuSO ₄		2.4
ZnCl₂		1.5
CdCl₂		11

Chemical	Concn.(mM)	Residual activity(%)
PCMB	0.1	25
MIA	1.0< /td>	78
NaN₃	1.0	110
NaF	1.0< /td>	108
EDTA	1.0
KCN	1.0	94
o-Phenanthroline	1.0	13

PCMB, p-Chloromercuribenzoate; MIA, Monoiodoacetate; EDTA , Ethylenediaminetetraacetate.

Fig.1. Stability (Powder form)
(kept under dry conditions)
Fig.2. Stability (Powder form)
(kept under dry conditions)
Fig.3. Stability (Liquid form at 37℃)
enzyme concentration: 400-500U/ml buffer composition: 50mM K-phosphate buffer contg.3.2M ammonium sulfate and 0.2% BSA .0
Fig.4. pH-Activity
(25℃, in 0.1M K₂CO_{3< /sub>-NaHCO₃ buffer)}
Fig.5. Temperature activity
(in 0.1M K₂ CO₃-NaHCO₃ buffer, pH10.5)
Fig.6. pH-Stability
25℃, 20hr-treatment with 50mM buffer solution pH4.0-6.0,acetate: pH6.0-8.5, K-phosphate;pH9.0-11.8, K₂CO₃- NaHCO₃
Fig.7. Thermal stability
15min-treatment with 50mM K-phosphate buffer, pH 7.5< /p>

활성 측정법(Japanese)

1. 원리

NADH의 생성량을 340nm의 흡광도 변화로 측정한다.

2. 정의

하기 조건 하에서 1분에 1 마이크로몰의 NADH를 생성하는 효소량을 1단위 (U) 한다.

3. 시약

0.2M K₂CO₃ -NaHCO3 완충액, pH11.0
0.3M 글리세롤 수용액
1.0M 황안 용액
10mM NAD⁺ 수용액(용 시간 준비)

효소 용액 : 효소 표제를 미리 빙냉시킨 20mM K- 인산 완충액, pH 7.5에서 용해시키고, 동일한 완충액으로 0.10 〜0.25U/ml로 희석하여 얼음 냉각 저장한다.

4. 절차

1.하기 반응 혼합물을 사용 직전에 제조한다.

30.0ml	K₂CO ₃-NaHCO₃완충액	(A)
20.0ml	기질 용액	(B)
2.0ml	황안 용액	(C)
6.0ml	NAD⁺수용액	(D)

pH가 10.0〜 10.5로 준비하고 갈색 병에서 얼음 차가운 보관한다.

2. 반응 혼합물 2.9ml를 큐벳(d=1.0cm)에 넣고 25시간 동안 약 5분간 예비 가온한다.

3.③ 분광 광도계로 340 nm의 흡광도 변화를 3 & 301C;

4. 맹검은 반응 혼합액 2.9ml로, 효소 용액 대신에 효소 희석액(20mM K-인산 완충 액, pH 7.5)를 0.1ml 첨가하고, 상기와 같이 조작을 행하여, 1분간 당의 흡광도 변화를 구한다(ΔOD blank).

5. 수식

U/ml=
ΔOD/min (ΔOD test−ΔOD blank)×3.0(ml)× 희석 배율
6.22×1.0×0.1(ml)

< /tr>

	= ΔOD/min×4.82×희석 배율
U/mg	= U/ml× 1/C
6.22	: NADH의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm²/micromole)
1.0	: 광로 길이(cm)
C	: 용해 시 효소 농도 (c mg/ml)

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