진단시약원료 효소

준비 및 사양

< tbody>< /tr>
성상백색 무정형 분말, 동결건조
활동GradeII 100 U/mg-solid 이상
오염물질NADH 산화효소≤1.0×10-2%

속성

안정성−20℃에서 안정적 ; 최소 1년 동안(그림 1)
분자량 대략. 260,000
등전점5.6
미카엘리스 상수9.21×10-3M(NH3), 4.80×10-3M(α ;-케토글루타레이트) 7.8×10-5M(L-글루타메이트), 1.29×10-4M(NADH), 5.89×10-4M(NAD＋)
구조효소 분자당 6개의 하위 단위
억제제중금속, PCMB, IAA
최적 pH 7.5−8.0 (α-KG→L-Glu) 9.0 (L-Glu→α-KG)(그림 2) span>
최적 온도55℃ (α-KG→L-Glu) 50℃ (L-Glu→α-KG)(그림 3)
pH 안정성 pH 5.0−10.0(25℃, 20시간)(그림 4)
열 안정성50℃ 미만 (pH 8.3, 10분)(그림 5)
기질 특이성(표 1)
다양한 화학물질의 영향(표 2)

애플리케이션

이 효소는 NH3, α-케토글루타르산 및 L-글루탐산의 효소 측정과 류신 아미노펩티다제 및 요소분해효소 분석에 유용합니다. 이 효소는 임상 분석에서 요소분해효소(URH-201)와 결합된 요소의 효소적 측정에도 사용됩니다.

분석

원리

NADH의 소멸은 분광 광도법으로 340nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 1개 단위는 분당 1마이크로몰의 NADH를 산화시킵니다.

방법

시약

< 번째 align="왼쪽">D. NADH 용액
아. 완충액0.1M Tris-HCl 완충액, pH 8.3
B. NH4Cl 용액3.3M
C. α-케토글루타레이트 용액0.225M(NaOH를 사용하여 pH를 7.0−9.0으로 조정)(신선하게 페파 처리해야 함)
7.5mM(신선하게 준비해야 함)
E. 효소 희석제0.1M Tris-HCl 완충액, pH 8.3

절차

1. 다음 반응 혼합물을 큐벳(d=1.0cm)에 준비하고 30°C에서 평형화합니다. 약 5분간 담가주세요.

2.5ml버퍼 용액(A)
0.2mlNH4 Cl 용액(B)
0.1mlα-케토글루타레이트 용액(C)
0.1mlNADH 용액(D)
분석 혼합물의 농도
Tris-HCl 완충액86mM
α-케토글루타레이트7.6mM
NH4Cl0.22M
NADH0.25mM
< /div>

2. 효소액 0.05ml*를 넣고 가볍게 뒤집어 섞어주세요.

3. 30°로 온도가 조절된 분광 광도계에서 물에 대해 2~3분 동안 340nm에서 광학 밀도의 감소를 기록하고 곡선의 초기 선형 부분에서 분당 OD를 계산합니다(&# x394;OD test).

동시에 효소희석액(E )가 효소 용액 대신 추가됩니다.

*얼음으로 효소 제제를 0.1−0.8U/ml로 녹입니다. -차가운 희석제(E), 분석 직전.

계산

활동은 다음과 같습니다. 다음 공식을 사용하여 계산합니다:

  • 부피 활동(U/ml) =

  • ΔOD/min (ΔOD 테스트−ΔOD 공백)×Vt×df

    6.22×1.0×Vs

  • = ΔOD/min×9.486×df

체중활동량(U/mg) = (U/ml)×1/C

< tbody>
Vt: 총 용량(2.95ml)
Vs: 샘플량(0.05ml)
6.22: 340nm에서 NADH의 밀리몰 흡광계수(cm< sup>2/마이크로몰)
1.0: 빛의 경로 길이(cm)
df: 희석 인자
C: 용해시 효소 농도(c mg/ml)

표 1. 글루타메이트 탈수소효소의 기질 특이성

  • 기질(2mM)상대 활성도(%)
    L-글루타메이트100
    L-노르발린0.35
    L-α-아미노부티레이트0.16
    L-노르류신0
    D,L-호모시스테인0.06
    L-이소류신0.09
  • < table class="darkGray">기판(2mM)상대 활성( %)L-글루타민0.05L- 아스파라긴산0.07L-아스파라긴0.11L- 발린0.09L-류신0.03L- 알라닌0.07L-메티오닌0.06

글루타메이트 탈수소효소: 0.3U/ml의 0.1M Tris-HCl 완충액, pH 9.0 NAD+:12mM

표 2. Effect of Various Chemicals on Glutamate dehydrogenase

[The enzyme dissolved in 0.1M Tris-HCl buffer, pH 8.3 was incubated with each chemical at 25℃ for 1 >

  • < td align="left">< tr>
    ChemicalConcn.(mM)Residual
    activity(%)
    None-100
    Metal salt2.0< /td>
    MgCl297
    CaCl299
    Ba(OAc)2101
    FeCl31.8
    CoCl297
    MnCl278
    ZnSO46.9
    Cd(OAc)2 58
    NiCl< sub>2100
    CuSO40.3
    Pb(OAc)20.01
    AgNO31.6
    HgCl20
    PCMB2.00.6
    MIA2.098
  • < tr>< td align="left">2.0< td align="left">96< /tbody>
    ChemicalConcn.(mM)Residual
    activity(%)
    NaF2.0100
    NaN320102
    EDTA5.0102
    o-Phenanthroline 2.0101
    α,α′-Dipyridyl102
    Borate102
    IAA2.0< /td>0.2
    NEM2.0
    Hydroxylamine2.0100
    Triton X-1000.10%102
    Brij 350.10%103
    Tween 200.10%101
    Span 200.10%107
    Na-cholate0.10%103
    SDS0.05%0.1
    DAC0.05%0.2

Ac, CH3CO; PCMB, p-Chloromercuribenzoate; MIA, Monoiodoacetate ; NEM, N-Ethylmaleimide; IAA, Iodoacetamide; EDTA, Ethylenediaminetetraacetate; SDS, Sodium dodecyl sulfate; DAC, Dimethylbenzylalkylammonium chloride

  • Fig.1. Stability (Powder form)

    (kept under dry conditions)

  • Fig.2. pH-Activity

    Fig.2. pH-Activity

    ○̶ ;○,α-KG →L-Glu;●̶●L-Glu →α-KG in 0.1M buffer solution :pH5.7-7.6 K-phosphate,pH7.8-9.0,Tris-HCI; pH9.4-10.3, glycine-NaOH

  • Fig.3. Temperature activity

    Fig.3. Temperature activity

    ○̶○,α-KG →L-Glu;0.1M Tris-HCI buffer pH8.3;●̶& #x25CF;,L-Glu →α-KG:0.1M Tris-HCI buffer,pH9.0

  • < img src="images/GTD_211_img05.jpg" alt="Fig.4. pH-Stability">

    Fig.4. pH-Stability

    25℃, 20hr-treatment with 0.1M buffer solution: ○̶○,acetate;●̶●,K-phosphate,& #x25B3;̶△Tris-HCI;▲̶▲glycine-NaOH

  • Fig.5. Thermal stability

    Fig.5. Thermal stability

    10min-treatment with 0.1M Tris-HCI buffer, pH8.3

활성 측정법(Japanese)

1. 원리

NADH의 소실량을 340nm의 흡광도 변화로 측정한다.

2. 정의

하기 조건 하에서 1분간에 1 마이크로몰의 NADH가 산화되는 효소량을 1단위(U )로 한다.

3. 시약

  • 0.1M Tris-HCl 완충액, pH8.3
  • 3.3 M NH4Cl 수용액
  • 0.225M α-케토글루타르산 수용액(NaOH로 pH를 7.0~9.0으로 조정)(용시 조제)
    • < li> 7.5 mM NADH 수용액 (용시 준비)

효소 용액 : 분석 직전에 효소 표품을 미리 얼음 냉각 한 0.1M Tris-HCl 완충액, pH 8 .3으로 0.1~0.8U/ml로 희석한다.

4. 절차

1. 하기 반응 혼합물을 큐벳(d=1.0cm)으로 제조 30 ~ 약 5 분간 예비 가온한다.

2.5mlTris-HCl 완충액 (A)
0.2mlNH4Cl 수용액 (B)
0.1mlα-케토글루타르산 수용액 (C)
0.1mlNADH 수용액(D)

2. 효소 용액을 0.05 ml 첨가하고, 완만하게 혼합한 후, 물을 대조군에 30&# x2103;로 제어된 분광광도계로 340nm의 흡광도 변화를 2~3분간 기록하고, 그 초기 직선 부분으로부터 1분간 당의 흡광도 변화를 구한다(ΔODtest).

3. 맹검은 반응 혼합액으로 효소 용액 대신 효소 희석액(0.1M Tris-HCl 완충액, pH 8 .3)을 첨가하고, 상기와 같이 조작하여 1 분당 흡광도 변화를 구한다 (ΔODblank).

5. 수식

  • U/ml=

  • ΔOD/min (ΔOD test−ΔOD blank)×2.95(ml)× 희석 배율

    6.22×1.0×0.05(ml)

< /tr>
= ΔOD/min×9.486×희석 배율
U/mg= U/ml× 1/C
6.22: NADH의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm2/micromole)
1.0: 광로 길이(cm)
C: 용해 시 효소 농도 (c mg/ml)

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