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진단시약원료 효소

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준비 및 사양

< tbody>

외관	0.05% NaN3 및 5.0mM EDTA가 포함된 50mM Tris-HCl 완충액, pH 7.8< /td>
활동성	GradeII・III 300U/mg-단백질 이상 (9,000U/ml 이상 더보기)
오염물질	NADPH 산화효소	≤1.0×10 ^-2%
	글루타티온 환원효소	≤1.0×10^-2% (등급Ⅱ-209)
		≤1.0×10^-1%(등급Ⅲ-309)
안정제	에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)

속성

< table class="darkGray">안정성4℃에서 안정적 최소 1년 동안(그림 1,2)분자량 약. 300,000등전점4.6미카엘리스 상수1.1×10^-3M(NH₃), 3.4×10^{- 4}M(α-케토글루타레이트) 1.2×10^-3M(L-글루타메이트), 1.4×10^-5M(NADPH), 1.5×10^-5M(NADP⁺)구조< /th>효소 분자당 6개의 하위 단위(MW50,000)억제제Hg< sup>++, Cd⁺⁺, p-클로로머쿠리벤조에이트, 피리딘, 4-4'-디티오피리딘, 2,2'-디티오피리딘최적 pH8.5(α-KG→L-Glu) 9.8(L-Glu→α-KG) (그림 5)최적 온도 45℃ (α-KG→L-Glu) 45−55℃ (L-Glu→α-KG)(그림 6)pH 안정성pH 6.0~8.5(25℃, 20시간)(그림 7)열 안정성50℃ 미만 (pH 7.4, 10분)(그림 8)기질 특이성< /th>(표 1)

응용

이 효소는 NH₃, α-케토글루타르산 및 L의 효소적 측정에 유용합니다. -글루타민산, 류신 아미노펩티다제 및 우레아제 분석용. 이 효소는 임상 분석에서 요소분해효소(URH-201)와 결합된 요소의 효소적 측정에도 사용됩니다.

분석

원리

NADPH의 소멸은 분광 광도법으로 340nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 1개 단위는 분당 1마이크로몰의 NADPH를 산화시킵니다.

방법

시약

< 번째 align="left" class="w33p">D. NADPH 용액

아. 완충액	0.1M Tris-HCl 완충액, pH 8.3
B. NH4Cl 용액	3.3M
다. α-케토글루타레이트 용액	0.225M(NaOH를 사용하여 pH를 7.0−9.0으로 조정)(신선하게 준비해야 함)
7.5mM(신선하게 준비해야 함)
E. 효소 희석제	50mM K-인산염 완충액, pH 6.6, 0.2% BSA 및 50mM EDTA 함유

절차

1. 다음 반응 혼합물을 큐벳(d=1.0cm)에 준비하고 30°C에서 평형화합니다. 약 5분 동안.

2.5ml	버퍼 용액	(A)
0.2ml	NH₄Cl 용액	(B)
0.1ml	α-케토글루타레이트 용액	(C)
0.1ml	NADPH 용액	(D)

분석 혼합물의 농도
Tris-HCl 완충액	85mM
α-케토글루타레이트	7.6mM
NH₄Cl	0.22M
NADPH	0.25mM
EDTA	0.85mM

2 . 효소액 0.05ml^*를 넣고 가볍게 뒤집어 섞어주세요.

3. 30°로 온도 조절된 분광 광도계에서 물에 대해 2~3분 동안 340nm에서 광학 밀도의 감소를 기록합니다. 곡선의 선형 부분에서 분당 ΔOD를 계산합니다(ΔOD 테스트).

동시에 동일한 방법을 사용하여 공백률(ΔOD 공백)을 측정합니다. 효소 용액 대신 효소 희석제(E)를 첨가하는 것을 제외하고는 테스트하십시오.

^*효소 제제를 다음과 같이 희석하십시오. 0.4−0.9U/ml, 얼음처럼 차가운 효소 희석제(E) 포함, 분석 직전.

계산

활동량은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다.

활동량(U /ml) =
ΔOD/min (ΔOD 테스트−ΔOD 공백)×Vt×df

6.22×1.0×Vs
= ΔOD/min×9.486 ×df

< /tr>

Vt	: 총 용량(2.95ml )
Vs	: 샘플량(0.05ml)
6.22	: NADPH의 밀리몰 흡광계수(cm²/마이크로몰)
1.0	: 광선 길이(cm)
df	: 희석 계수

참조

< 스팬>1) H.Shimizu, T.Kuratsu 및 F.Hirata; J.Ferment.Technol., 57, 428 (1979).

표 1. 글루타메이트 탈수소효소의 기질 특이성

기판(50mM) 상대활성도(%)
L-글루타메이트 100
L-노르발린 0.39
L-α- 아미노부티레이트 0.19
L-노르류신 0.04
D, L-호모시스테인 0.03
L-이소류신 0.02
< th align="center" class="w70p">기판(50mM)
상대 활성도(%)

L-글루타민 < 0.01
L-아스파르트산염 < 0.01
L-아스파라긴 < 0.01
L-발린 < 0.01
L-류신 < 0.01
L-알라닌 < 0.01
L-메티오닌 < 0.01

기판(50mM)	상대활성도(%)
L-글루타메이트	100
L-노르발린	0.39
L-α- 아미노부티레이트	0.19
L-노르류신	0.04
D, L-호모시스테인	0.03
L-이소류신	0.02

상대 활성도(%)
L-글루타민	< 0.01
L-아스파르트산염	< 0.01
L-아스파라긴	< 0.01
L-발린	< 0.01
L-류신	< 0.01
L-알라닌	< 0.01
L-메티오닌	< 0.01

글루타메이트 탈수소효소: 0.1M 글리신-NaOH 완충액 18U/ml , pH 9.0 NADP⁺: 0.3mM

그림 1. 안정성(GTD-209)(용액)
25mM Tris-HCI 완충액 함유 50% 글리세롤 용액. 2.5mM EDTA, pH7.8 효소 농도: 5,000U/ml
그림 2. 안정성(GTD-309)(용액)
25mM Tris-HCI 완충액 함유 50% 글리세롤 용액. 2.5mM EDTA, pH7.8 효소 농도: 5,000U/ml
그림 3. 안정성(용액)
25mM Tris-HCI 완충액 함유 50% 글리세롤 용액. 2.5mM EDTA, pH7.8 효소 농도: 5,000U/ml
그림 4. 안정성(현탁액)
5mM EDTA가 포함된 50mM Tris-HCI 완충액에 담긴 3.0M 황산암모늄 현탁액. pH7.8 효소 농도 : 10,000U/ml
그림 5. pH-활성
○̶̶○,α-KG →L-Glu;● 0.1M 완충액 내 L-Glu-KG:pH7.4-8.8, Tris-HCI;pH8.7-10.7,글리신-NaOH
그림 6. Temperature activity
○̶̶○,α-KG→L-Glu: 0.1M Tris-HCI buffer , pH8.3;●̶̶● , L-Glu→α-KG:0.1M glycineNaOH buffer,pH10.0
Fig.7. pH-Stability
25℃, 20hr-treatment with 0.1M buffer solution: pH4.4-6.2, acetate; pH6.2-8.4 , phosphate; pH8.8-10.2, glycine-NaOH
Fig.8. Thermal stability
10min-treatment with 0.1M K-phosphate buffer,pH7.4< /p>

활성 측정법(Japanese)

1. 원리

NADPH의 소실량을 340nm의 흡광도 변화로 측정한다.

2. 정의

하기 조건 하에서 1분간에 1 마이크로몰의 NADPH가 산화되는 효소량을 1단위(U )로 한다.

3. 시약

0.1M Tris-HCl 완충액, pH8.3
3.3 M NH4Cl 수용액 0.225M - 케토글루타르산 수용액 (NaOH로 pH를 7.0 & 9.0으로 조정) (용시 조제) (용시 조제)

효소 용액: 분석 직전에 효소 표품을 미리 빙냉한 0.2%BSA와 50mM EDTA를 포함하는 50mM K인산 완충액, pH 6.6에서 0.4〜0.9U/ml로 희석한다.

4. 절차

1. 하기 반응 혼합물을 큐벳(d=1.0cm)으로 제조 30 ~ 약 5 분간 예비 가온한다.

< td class="pl20 w30p">(A)< td class="pl20">(B)

2.5ml	Tris-HCl 완충액
0.2ml	NH₄Cl 수용액
0.1ml	α-케토글루타르산 수용액	(C)
0.1ml	NADPH 수용액	(D)

2. 효소 용액을 0.05ml 첨가하고 완만하게 혼합한 후, 물을 대조군에 30&# x2103으로 제어 된 분광 광도계로 340nm의 흡광도 변화를 2 & 301C;

3. 맹검은 반응 혼합물 ①에 효소 용액 대신에 효소 희석액(0.2%BSA와 50mM EDTA를 포함한 K - 인산 완충액, pH 6.6)을 첨가하고 상기와 동일한 조작을 행하여 1 분당 흡광도 변화를 구한다 (ΔODblank).

5. 수식

U/ml=
ΔOD/min (ΔOD test-ΔOD blank)×2.95(ml)×희석 배율
6.22×1.0×0.05(ml)

	= Δ OD/min×9.486×희석 배율
6.22	: NADH의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm²/micromole)
1.0	: 광로 길이(cm)