TOYOBO BIO

진단시약원료 효소

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준비 및 사양

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외관	연노란색 무정형 분말, 동결건조
활동성	GradeⅠ 15U/mg-solid 이상 (BSA 약 30% 함유)
오염물질	α-아밀라아제	≤5.0×10^-4%
안정제	BSA, 글루타티온(감소)

속성

안정성	−20℃에서 안정적 최소 1년 동안(그림 1)
분자량	약. 110,000
등전점	7.3 ¹⁾
미카엘리스 상수	2.8×10^-3M (p-Nitrophenyl-β- D-글루코피라노사이드), 3.3×10^-3M(2,4-디클로로페닐-β-D-글루코피라노사이드)
구조	효소 분자당 2개의 하위 단위
최적의 pH	5.5(그림 4)
최적 온도	50−55℃(그림 5)
pH 안정성	pH 6.0~9.0(25℃, 64시간)(그림 6)
열 안정성	50℃ 미만 (pH 7.3, 1시간)(그림 7)
다양한 효과 화학물질	(표 1)

응용

이 효소는 탄수화물의 구조 조사 및 α-아밀라아제와 결합 시 효소적 결정에 유용합니다. #x3B1;-글루코시다아제(AGH-211) 임상 분석.

분석

원칙

Principle

p-니트로페놀의 외관은 분광광도법으로 400nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 1단위는 분당 1마이크로몰의 PNP를 형성합니다.

방법

시약

A. 아세트산 완충액, pH 5.0(25℃)	0.1M
비. PNPG 용액	20mM(603mg p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside/100ml H₂O)(0−에서 보관하면 2주 동안 안정함) 5℃)
다. Na₂CO₃ 용액	0.2M(21.2g Na₂CO₃ H₂O)
D. 효소 희석제	10mM 인산 완충액, BSA 0.2% 함유 pH 7.0.

2. 효소액 0.5ml^*를 넣고 섞어주세요.

3. 37°에서 정확히 15분 후 Na₂CO₃ 용액(C) 2.0ml를 첨가하여 반응을 중지하고 37°C에서 광학 밀도를 측정합니다. 물에 대한 400nm(OD 테스트).

동시에 먼저 반응 혼합물을 Na₂CO 2.0ml와 혼합하여 블랭크를 준비합니다₃ 용액(C), 37℃에서 15분간 배양한 후 효소 용액(OD 공백)을 추가합니다.

^*효소 제제를 얼음처럼 차가운 50mM Tris-HCl 완충액 pH 7.8(약 1mg/ml)에 녹이고 효소 희석제(D)를 사용하여 0.006−0.022U/ml로 희석합니다. , 분석 직전.

계산

활동은 다음을 사용하여 계산할 수 있습니다. 공식 :

볼륨 활동(U/ml) =
ΔOD(OD 테스트−OD 공백)×Vt×df
18.1×1.0×t×Vs
= ΔOD×0.0295×df

체중 활동량(U/mg) = (U/ml)×1/C

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Vt	: 총 용량(4.0ml)
Vs	: 샘플 용량(0.5ml)
18.1	: 분석 조건에서 p-니트로페놀의 밀리몰 흡광 계수(cm²/마이크로몰)
1.0	: 빛의 경로 길이(cm)
t	: 반응 시간(15분)
df	: 희석 계수
C	: 용해 시 효소 농도(c mg/ml)

참조

1) AKGrover, DDMacmurchie RJCushley; Biochim.Biophys.Acta, 482, 98 (1977).

(아몬드의 β-글루코시다제 특성)

2) R.Heyworth와 PGWalker; Biochem.J., 83, 331(1962).

3) JHHash 및 KWKing; J.Biol.Chem., 232, 395 (1958)

표 1. Effect of Various Chemicals on β-Glucosidase

[Residual activity after 1 hr-treatment at 30℃.]

< tr>< td align="left">93.9< td align="left">
Chemical Concn.(mM) Residual
activity(%)

None - 100
Metal salt 0.5
CaCl₂ 92.7
FeSO₄ 94.1
CoCl₂ 95.5
ZnCl₂ 95.0< /td>
CuSO₄ 94.5
HgCl₂ 99.8
CrCl₂
MgSO₄ 96.8
SnCl₂ 93.6
CdCl₂ 93.0
AgNO₃ 92.7
NiCl₂ 95.5

Chemical	Concn.(mM)	Residual activity(%)
None	-	100
Metal salt	0.5
CaCl₂		92.7
FeSO₄		94.1
CoCl₂		95.5
ZnCl₂		95.0< /td>
CuSO₄		94.5
HgCl₂		99.8
CrCl₂
MgSO₄		96.8
SnCl₂		93.6
CdCl₂		93.0
AgNO₃	92.7
NiCl₂		95.5

Chemical	Concn.(mM)	Residual activity(%)
MnCl₂		94.3
BaCl₂		93.9
FeCl₃		99.8
o-Phenanthroline	0.5	94.3
α,α′-Dipyridyl	0.5	94.3
Borate	25	94.1
PCMB	0.05	94.5
MIA	0.5	89.3
NaF	0.5	96.6
NaN₃	10	98.9
EDTA	5.0	96.1
Triton X-100	0.5%	102.3
Na-cholate	0.5%	99.5

PCMB, p-Chloromercuribenzoate; MIA, Monoiodoacetate; EDTA, Ethylenediaminetetraacetate.

Fig.1. Stability (Powder form)
(kept under dry conditions)
Fig.2. Stability (Powder form)
(kept under dry conditions)
Fig.3. Stability (Liquid form at 25℃)
(enzyme concentration: 1.0mg/ml buffer composition: 50mM Tris-HCI buffer, pH7.8)
그림 4. pH-Activity
(37℃.15 min-reaction in 50mM acetate buffer.)
Fig.5. Temperature activity
(15 min-reaction in 50mM acetate buffer, pH5.0)
Fig.6. pH-Stability
(25℃ , 64hr-treatment with 50mM buffer solution:pH3.5-6.0, acetate; pH6.5-9.0, Tris-HCI)
Fig.7. Thermal stability
(1hr-treatment with 50mM Tris-HCI buffer,pH7.3.)

활성 측정법(Japanese)

1. 원리

p-Nitrophenol의 생성량을 400nm의 흡광도 변화로 측정한다.

2. 정의

하기 조건 하에서 1분에 1 마이크로몰의 p-Nitrophenol을 생성하는 효소량을 1단위( U)로 한다.

3. 시약

0.1M 아세트산 완충액, pH5.0(25℃)
20mM PNPG 수용액 (603mg의 P- 니트로 페닐 β-D- 글루코 피라노 사이드를 100ml의 증류수에 교반 용해시킨다) (0 & # x301C; li> 0.2M Na ₂CO₃ 용액 (21.2g의 무수 탄산나트륨을 증류수에 용해시켜 1,000ml로 만든다)

< 효소 용액 : 효소 표본을 미리 얼음으로 냉각시킨 50mM Tris-HCl 완충액 pH 7.8에서 약 1mg / ml에 용해시키고 분석 직전에 0.2 % 소혈청 알부민 (BSA)을 함유 한 10mM 인산염 완충액, pH 7.0에서 0.006〜0.022U/ml로 희석한다.

4. 절차

1. 시험관에 하기 반응 혼합물을 제조하고, 37℃ ;로 약 5분간 예비가온한다.

1.0ml	0.1M 아세트산 완충액, pH5.0< /td>	(A)
0.5ml	기질 용액	(B)

2. 효소 용액을 0.5ml 첨가하고 반응을 개시한다 한다.

3.37℃에서 정확하게 15분 동안 반응시킨 후, Na₂CO₃ 용액 (C) 2.0ml를 첨가하여 반응을 정지시킨다. 이 용액 당 400 nm에서의 흡광도를 측정한다 (OD test).

4.맹검은 반응혼액①을 37℃로 15분간 방치한 후, Na₂CO₃ 용액(C) 2.0ml를 가하여 혼화시킨 후, 효소 용액 0.5ml를 가하여 조제한다. 이하와 같이 흡광도를 측정한다 (ODblank).

5. 수식

U/ml=
ΔOD(OD test-OD blank)×4.0(ml)×희석 배율
< p class="txt_14">18.1×1.0×15(분)×0.5(ml)

	= & #x394;OD×0.0295×희석 배율
U/mg	= U/ml×1/C
18.1	: p-Nitrophenol의 상기 측정 조건 하에서 밀리몰 분자 흡광 계수(cm²/micromole)
1.0	: 광로 길이(cm)
C	: 용해시의 효소 농도 (c mg/ml)