진단시약원료 효소

준비 및 사양

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성상백색 무정형 분말, 동결건조
활동GradeII 20U/mg-solid 이상
오염물질α-아밀라아제 ≤1.0×10-5%
안정 장치BSA

속성

안정성−20℃에서 안정적 최소 1년 동안(그림 1)
분자량약. 65,000(겔 여과 및 SDS-PAGE)
등전점5.2
미카엘리스 상수6.3×10-4M (p-Nitrophenyl-α- D-글루코피라노사이드)
억제제Ag＋, Hg ＋＋, PCMB, MIA
최적 pH6.0−7.0(그림 4)
최적 온도60℃< span class="floatRight">(그림 5)
pH 안정성pH 5.0−9.0(그림 6)
다양한 화학물질의 영향(표 1)
열 안정성60℃ 미만 (pH 7.0, 15분)(그림 7)
< td>284.0
기질*상대 가수분해 rate**기질*상대 가수분해 속도**
PNPG100.0맥아당271.0
PNPG2205.0말토트리오스203.0
PNPG3말토테트라오스168.0
PNPG5164.0 말토펜타오스100.0

* : 기판 농도. 2.2mM
**: 포도당 형성 활동, pH 6.8, 37℃

응용 프로그램

이 효소는 탄수화물의 구조적 조사와 헥소키나제(HXK-311) 및 G-6-와 결합하여 '-아밀라제'의 효소적 결정에 유용합니다. P 탈수소효소(G6D-311, G6D321) 임상 분석.

분석

원칙

Principle

p-니트로페놀의 외관은 분광광도법으로 400nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 1단위는 분당 1마이크로몰의 PNP를 형성합니다.

방법

시약

A. 0.1M 인산염 완충액, pH 7.0(25℃)
B. PNPG 용액20mM(P-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside 603mg/H2O 100ml)(0-5℃에서 보관하면 2주 동안 안정함)
다. Na2CO3 용액0.2M (21.2g Na2CO3 / H2O)
D. 1,000ml 효소 희석제0.2M K-인산염 완충액, 1mM의 EDTA와 0.05%의 Tween 20을 함유한 pH 7.0

절차

1. 시험관에 다음 반응 혼합물을 준비하고 37℃에서 평형을 이룹니다. 약 5분 동안.

1.0ml0.1M 인산염 완충액< /td>(A)
0.5ml기질 용액(B)
< td align="right" class="w50p">0.1M
분석 혼합물의 농도
인산염 완충액
PNPG5.0mM
EDTA0.25mM
트윈 200.125mg/ml

2. 효소액 0.5ml*를 넣고 섞어주세요.

3. 37°에서 정확히 15분 후 Na2CO3 용액(C) 2.0ml를 첨가하여 반응을 중지하고 37°C에서 광학 밀도를 측정합니다. 물에 대한 400nm(OD 테스트).

동시에 먼저 반응 혼합물을 Na2CO 2.0ml와 혼합하여 블랭크를 준비합니다3 용액(C), 37℃에서 15분간 배양한 후 효소 용액(OD 공백)을 추가합니다.

*분석 직전에 효소 제제를 얼음처럼 차가운 효소 희석제(D)에 녹이고 동일한 완충액으로 0.006−0.022U/ml로 희석합니다.

계산

활동은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다:

  • 활동량(U/ml) =

  • ΔOD(OD 테스트−OD 공백)×Vt×df

    18.1×t×1.0×Vs

  • = ΔOD×0.0295×df

체중 활성도(U/mg) = (U/ml)×1/C

Vt: 총 용량(4.0ml)
Vs: 샘플량(0.5ml)
18.1: 분석 조건 하에서 p-니트로페놀의 밀리몰 흡광 계수(cm2/마이크로몰)
1.0: 광선 길이(cm)
t: 반응 시간 (15분)
df: 희석 인자
C: 용해 시 효소 농도(c mg/ml)

참조

1) Y.Suzuki, M.Shinji 및 N.Eto; Biochim.Biophys.Acta., 787, 281(1984).

2) Y.Takii, K.Daimon 및 Y.Suzuki; Appl.Microbiol.Biotechnol., 38, 243 (1992).

3) Y.Takii, K.Takahashi, K.Yamamoto, Y. 소가베와 Y.스즈키; Appl.Microbiol.Biotechnol., 44, 629 (1996).

표 1. α-글루코시다제에 대한 다양한 화학물질의 영향

［10mM 인산염 완충액, pH 7.0 contg에 용해된 효소. 0.2% of BSA (5U/ml) was incubated with each chemical at 25℃ for 1hr.]

  • < td align="left">39< td align="left">
    ChemicalConcn.(mM )Residual
    activity(%)
    None-100
    Metal salt 2.0
    MgSO4< /sub>97
    CaCl271
    Ba(OAc)2106
    FeCl250
    CoCl263
    MnCl269
    ZnCl2104< /td>
    CdCl247
    NiCl2110
    CuSO4
    Pb(OAc)275
    AgNO20.3
    HgCl21.2
    2-Mercaptoethanol2.0111
    PCMB 1.01.3
  • < tr>< td align="left">0.10%
    ChemicalConcn.(mM)Residual
    activity(%)
    MIA2.00.8
    NEM2.0120
    IAA2.0106
    Hydroxylamine2.0115
    EDTA< /td>5.0112
    o-Phenanthroline2.0114
    α,α ;′-Dipyridyl1.0122
    Borate 50119
    NaF 2.0118
    NaN3 2.0123
    Triton X-100< /td>0.10%123
    Brij 350.10%121
    Tween 20124
    Span 200.10%43
    Na-cholate0.10%102
    SDS0.05%10
    DAC0.05% 124

Ac, CH3CO; PCMB, p-Chloromercuribenzoate; MIA, Monoiodoacetate; NEM, N-Ethylmaleimide; IAA, Iodoacetamide; EDTA, Ethylenediaminetetraacetate; SDS, Sodium dodecyl sulfate; DAC, p>

  • Fig.1. Stability (Powder form)

    Fig.1. Stability (Powder form)

    (kept under dry conditions)

  • Fig.2. Stability (Powder form)

    그림 .2. Stability (Powder form)

    (kept under dry conditions)

  • Fig.3. Stability (Liquid form)

    Fig.3. Stability (Liquid form)

    < p class="txt">in 50mM PIPES buffer solution, pH7.0 (contg. 0.5mM CaCl2, 0.1% detergent) enzyme concn,:5U/ml

  • Fig.4. pH-Activity

    그림. 4. pH-Activity

    37℃, 15 min-reaction in 100mM buffer solution: ●, pH4.0-6.0 acetate ; O, pH6.0-8.0 , phosphate; ■, pH8.0-9.0, borate

  • Fig.5. Thermal activity

    Fig.5. Thermal activity

    15 min-reaction in 100mM phosphate buffer, pH7.0

  • Fig.6. pH-Stability

    Fig.6. pH-Stability

    25℃, 20hr-treatment with 50mM buffer solution contg; 0.2% of BSA: ●, pH4 .0-6.0 acetate: ○, pH6.0-8.0, phosphate; ■, pH8.0-9.0, borate. enzyme concn. : 5U/ml

  • Fig.7. Thermal stability

    Fig.7. Thermal stability

    15min-treatment with 0.2M K-phosphate buffer, pH7.0 contg. 1mM EDTA and 0.05% Tween20. enzyme concn.: 5U/ml

활성 측정법(Japanese)

1. 원리

원리

p-Nitrophenol 생성량 400nm의 흡광도 변화로 측정한다.

2. 정의

하기 조건 하에서 1분에 1 마이크로몰의 p-Nitrophenol을 생성하는 효소량을 1단위( U)로 한다.

3. 시약

  • 0.1M 인산염 완충액, pH 7.0 (25℃)
  • 20mM PNPG 수용액[603mg의 P-니트로페닐-α-D-글루코피라노사이드를 100ml의 증류수에 교반 용해한다](1~5℃ 보존으로 2주간은 사용 가능)
  • 0.2M Na2CO3 용액(21.2g의 무수 탄산나트륨을 증류수에 용해시켜 1,000ml로 한다)

효소 용액: 효소 표품을 미리 빙냉했다 1mM EDTA · 2Na 및 0.05 % Tween20을 함유하는 0.2M 인산 완충액, pH 7.0에서 용해시키고 0.006 & # x301C; 0.022U / ml로 희석한다.

4. 절차

1. 시험관에 하기 반응 혼합물을 제조하고, 37℃ ;로 약 5분간 예비가온한다.

1.0ml인산염 완충액, pH 7.0(A)
0.5ml기질 용액 (B)

2. 효소 용액을 0.5 ml 첨가하고 반응을 개시한다.

3.37℃에서 정확하게 15분 동안 반응시킨 후, Na2CO3 용액 (C) 2.0ml를 첨가하여 반응을 정지시킨다. 이 용액 당 400 nm에서의 흡광도를 측정한다 (OD test).

4.맹검은 반응혼액①을 37℃로 15분간 방치한 후, Na2CO3 용액(C) 2.0ml를 가하여 혼화시킨 후, 효소 용액 0.5ml를 가하여 조정한다. 이하와 같이 흡광도를 측정한다 (ODblank).

5. 수식

  • U/ml=

  • ΔOD(OD test-OD blank)×4.0(ml)×희석 배율

    < p class="txt_14">18.1×1.0×15(분)×0.5(ml)

= & #x394;OD×0.0295×희석 배율
U/mg= U/ml×1/C
18.1: p-Nitrophenol의 상기 측정 조건 하에서 밀리몰 분자 흡광 계수(cm2/micromole)
1.0: 광로 길이(cm)
C: 용해시의 효소 농도 (c mg/ml)

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