진단시약원료 효소

준비 및 사양

< tbody>
외관 백색 무정형 분말, 동결건조
활동GradeⅢ 200U/mg-solid 이상
오염물질 크레아틴 포스포키나제≤1×10-3%
포스포글루코뮤타제≤1×10-3%
6-포스포글루코네이트 탈수소효소≤5×10-3%
인산글루코스 이성질화효소&# x2264;1×10-2%
글루타티온 환원효소≤1×10-3 %
헥소키나아제≤1×10-2%
미오카나아제≤1×10-2%
NADH 산화효소< /td>≤1×10-2%
NADPH 산화효소≤ 1×10-2%

속성

안정성안정적 −20℃ 최소 1년 동안(그림 1)
분자량약. 140,000(겔 여과 기준)
미카엘리스 상수NAD+ 연결됨2.4× 10-4M(NAD+), 4.7×10-4M(G-6-P)
NADP+ 연결7.4×10-6M(NADP+) , 3.2×10-4M(G-6-P)
억제제금속 이온, 요오도아세트아미드, SDS 등
최적 pH7.8(그림 2)
최적 온도50−55℃(그림 3)
pH 안정성pH 5.0−11.0(25&# x2103;, 22시간)(그림 4)
열 안정성50℃ 미만 (pH 7.8, 30분)(그림 5)
기질 특이성(표 1)
다양한 화학물질의 영향(표 2)< /td>

애플리케이션

이 효소는 NAD+(NADP+) 및 G-6-P의 효소적 측정과 포스포글루코스 이소머라제, 포스포글루코뮤타제 및 헥소키나제의 활성에 유용합니다. 이 효소는 헥소키나제(HXK-311)와 결합하여 포도당과 크레아틴 포스포키나제 활성을 효소적으로 측정하는 데에도 사용됩니다.

분석

원리

Principle

NADH의 모양은 분광광도법으로 340nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 하나의 단위는 분당 1마이크로몰의 NADH를 형성합니다.

방법

시약

아. Tris-HCl 완충액, pH 7.855mM(3.3mM 염화마그네슘 함유)
비. NAD＋ 용액60mM(신선하게 준비해야 함)
씨. G-6-P 용액0.1M D-Glucose-6-인산(신선하게 준비해야 함)
라. 효소 희석제5mM Tris-HCl 완충액, pH 7.5, 0.1% 소 혈청 알부민 함유.

절차

1. 다음 반응 혼합물을 큐벳(d=1.0cm)에 준비하고 30°C에서 평형화합니다. 약 5분 동안.

2.7mlTris-HCl 완충액, pH 7.8(A)
0.1ml NAD＋ 용액(B)
0.1ml G-6-P 용액, pH 7.8(C)
분석 혼합물의 농도
Tris-HCl 버퍼50mM
G-6-P3.3mM
NAD＋2.0mM
MgCl23.0mM
BSA33μ ;g/ml

2. 효소액 0.1ml*를 넣고 가볍게 뒤집어 섞어주세요.

3. 30°로 온도가 조절된 분광 광도계에서 4~5분 동안 물에 대해 340nm에서 광학 밀도의 증가를 기록하고 곡선의 초기 선형 부분에서 분당 OD를 계산합니다(&# x394;OD test).

동시에 효소희석액(D)을 첨가하는 것을 제외하고는 시험과 동일한 방법으로 공시험률(ΔOD 공백)을 측정한다. 효소 용액 대신 첨가합니다.

*효소 제제를 얼음처럼 차가운 효소 희석제(D)에 녹이고 분석 직전에 동일한 완충액을 사용하여 0.05−0.20U/ml로 희석합니다.

계산

활동량은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다:

  • 활동량(U/ml) =

  • ΔOD/min(OD 테스트−OD 공백)×Vt×df

    6.22×1.0×Vs

  • = ΔOD/min×4.82×df< /p>

체중 활동량(U/mg) = (U/ml)×1/C

< /tr>< td>: 용해 시 효소 농도
Vt: 총 용량(3.0ml)
Vs: 시료량(0.1ml)
6.22: 분석 조건에서 NADH의 밀리몰 흡광계수(cm 2/마이크로몰)
1.0: 빛의 경로 길이(cm)
df: 희석 계수
C

표 1. 포도당의 기질 특이성 6-인산염 탈수소효소

[기질 3.3mM, Tris-HCl 완충액 50mM, pH 7.8]

  • < tr>
    기판상대 활성도(%)
    글루코스-6-인산염100
    과당-6-인산염0
    글루코스-1-인산0
    글루코네이트-6 -인산염0

표 2. Effect of Various Chemicals on Glucose-6-phosphate dehydrogenase

[The enzyme dissolved in 50mM Tris-HCl buffer, pH 7.5 (10U/ml) was incubated with each chemical 30℃.]

  • < td align="left">< td align="left">HgCl2< tr>
    ChemicalConcn.(mM)Residual
    activity(%)
    None-< /th>100
    Metal salt2.0
    AgNO374
    Ba(OAc)2100
    CaCl295
    Ca(OAc)284
    CoCl2 94
    CuSO< sub>484
    FeCl30
    FeSO40
    87
    MgCl2100
    MnCl297
    NiCl294
    Pb(OAc)231
    Zn(OAc)2< /td>63
    ZnSO476
    KF2.0103
    NaF2.099
    NaN32.0102
  • < td align="left">PCMB< /tr>< tr>< td align="left">Hydroxylamine
    ChemicalConcn.(mM)Residual
    activity(%)
    NEM2.094
    2.0103
    MIA2.099
    Iodoacetamide 2.00
    EDTA 5.0102
    (NH4)2SO420.099
    Borate20.098
    o-Phenanthroline2.0100
    α,α′-Dipyridyl2.0102
    Urea2.099
    Guanidine2.0100
    2.0100
    Na-cholate1.0%106
    Triton X-1001.0%104
    Brij 351.0%12
    SDS0.1%1
    Tween 20< /td>0.1%102
    Span 200.1%101
    DAC0.1%1
< p, class="p txt_14">Ac, CH3CO; NEM, N-Ethylmaleimide; PCMB, p-Chloromercuribenzoate; MIA, Monoiodoacetate; EDTA, Ethylenediaminetetraacetate; SDS, Sodium dodecyl sulfy .

  • Fig.1. Stability (Powder form )

    Fig.1. Stability (Powder form)

    (kept under dry conditions)

  • Fig.2. pH-Activity

    Fig.2. pH-Activity

    30℃ in the following buffer solution: pH6.0-7.0, 50mM PIPES pH7.2-9.0, 50mM Tris-HCI

    >

  • Fig.3. Temperature activity

    Fig.3. Temperature activity

    (in 50mM Tris-HCI buffer, pH7.8)

  • Fig.4. pH-Stability

    Fig.4. pH -Stability

    25℃, 22hr-treatment with the following 0.1M buffer solution: pH5.0-6.0,Acetate; pH6.0-9.0,K-phosphate; pH9. 0-11.0,Glycine-NaOH

  • Fig.5. Thermal stability

    Fig.5. Thermal stability

    30min-treatment with 5.0mM Tris-HCI buffer, pH7.8, containing 0.1% of bovine serum albumin

활성 측정법(Japanese)

< p class="ttl_16">1. 원리

원리

생성된 NADH의 생성량을 340nm에서의 흡광도의 변화로 측정한다.

2. 정의

하기 조건 하에서 1분에 1 마이크로몰의 NADH를 생성하는 효소량을 1단위(U) 한다.

3. 시약

  • 55mM Tris-HCl 완충액, pH 7.8(3.3mM MgCl2 포함)
  • 60 mM NAD+ 수용액(사용시 준비)
  • 0.1 M G-6-P(glucose-6-phosphate ) 수용액 (용시 조제)

효소 용액: 효소 표품을 미리 빙냉한 0.1% 소혈청 알부민(BSA)을 포함한 5mM Tris-HCl 완충액 , pH 7.5에서 용해시키고 분석 직전에 동일한 완충액으로 0.05 & # x301C; 0.20U / ml로 희석한다.

4. 절차

1. 하기 반응 혼합물을 큐벳(d=1.0cm)으로 제조 그런 다음 약 50 분간 예비 가온한다.

< td class="w20p">(A)
2.7mlTris-HCl 완충액
0.1mlNAD+수용액(B)
0.1ml기질 용액(C)

2. 효소 용액 0.1ml를 첨가하고, 완만하게 혼화 후, 물을 대조에 30℃으로 제어된 분광 광도계로 340nm의 흡광도 변화를 4〜5분간 기록하고, 그 초기 직선 부분으로부터 분당 흡광도 변화를 구한다(ΔODtest).

3. 맹검은 효소 용액 대신 효소 희석액 (0.1% BSA를 포함하는 5 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.5) 0.1ml를 첨가하고, 상기와 동일한 조작을 행하여 1 분당 흡광도 변화를 구한다.

5. 수식

  • U/ml=

  • ΔOD/min (OD test-OD blank)×3.0(ml)×희석 배율

    6.22×1.0×0.1(ml)

< /tr>< tr>
= Δ OD/min×4.82×희석 배율
U/mg= U/ml×1/C
6.22: 상기 측정 조건에서 NADH의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm2/micromole)
1.0: 광로 길이(cm)
C: 용해시 효소 농도(c mg /ml)

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