진단시약원료 효소

준비 및 사양

< tbody>< /tr>< /tr>
성상백색 무정형 분말, 동결건조
활동량GradeⅢ 400U/mg-solid 이상(NAD+)
오염물질크레아틴 포스포키나제≤1×10-3%
포스포글루코뮤타제≤1×10-3%
6- 포스포글루코네이트 탈수소효소≤5×10-3%
포스포글루코스 이성질화효소& #x2264;1×10-2%
글루타티온 환원효소≤1×10- 3%
헥소키나제≤1×10-2%
미오카나아제≤1×10-2%
NADH 산화효소 ≤1×10-2%
NADPH 산화효소≤ ;1×10-2%

속성

< td colspan="2">50℃(그림 5)
안정성−20℃에서 안정적 최소 1년 동안(그림 1)
5℃에서 안정적 최소 6개월 동안(액체 형태)(그림 3)
분자량104,000(약 55,000개의 하위 단위 2개) 1,2)
등전점 4.6 2)
Michaelis 상수 2)NAD+ 연결 1.06×10-4M (NAD+ ), 5.27×10-5M(G-6-P)
NADP+ 연결됨 5.69×10-6M(NADP+), 8.1×10-5M(G-6- P)
구조효소 분자에는 시스테인이나 시스틴 잔기가 모두 존재하지 않습니다 1) 및 필수 라이신이 활성 부위에 있는 것으로 나타납니다. 3)
억제제아실-CoA,4) ATP,4) 정신 이온 등 (표 1)
최적 pH7.8(그림 4)
최적 온도
pH 안정성< /th>pH 5.5−7.5(30℃, 17시간)(그림 6)
열 안정성37℃ 미만 (pH 8.0, 30분)(그림 7)
기질 특이성NAD+ 또는 NADP+가 보효소 역할을 하며 NAD+의 반응 속도는 NAD+보다 약 1.8배 더 빠릅니다. NADP.+5) D-글루코스는 느리게 반응하지만 D글루코스-6-인산은 효소에 대한 우선적인 기질입니다.6) 과당-6-인산염, 과당1, 6 -디포스페이트 및 리보스-5-인산염은 기질로 간주되지 않습니다.7)
< /div>

응용 프로그램

이 효소는 NAD+의 효소적 측정에 유용합니다. (NADP+) 및 G-6-P, 그리고 포스포글루코스 이소머라제, 포스포글루코뮤타제 및 헥소키나제의 활성. 이 효소는 헥소키나제(HXK-311)와 결합하여 포도당을 효소적으로 측정하는 데에도 사용됩니다.

분석

원칙

Principle

NADH의 모양은 분광광도법으로 340nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 하나의 단위는 분당 1마이크로몰의 NADH를 형성합니다.

방법

시약

아. Tris-HCl 완충액, pH 7.855mM(3.3mM 염화마그네슘 함유)
비. NAD＋ 용액60mM(신선하게 준비해야 함)
씨. G-6-P 용액0.1M 포도당-6-인산(신선하게 준비해야 함)
디. 효소 희석제5mM Tris-HCl 완충액, pH 7.5, 0.1% 소 혈청 알부민 함유.

절차

1. 다음 반응 혼합물을 큐벳(d=1.0cm)에 준비하고 30°C에서 평형화합니다. 약 5분 동안.

2.7mlTris-HCl 완충액 , pH 7.8(A)
0.1mlNAD ＋ 용액(B)
0.1mlG・6・P 용액 (C)
< td align="right">3.3mM
분석 혼합물의 농도
Tris- HCl 버퍼50mM
G-6-P
NAD+2.0 mM
MgCl23.0 mM
BSA33μg/ml

2. 효소액 0.1ml*를 넣고 가볍게 뒤집어 섞어주세요.

3. 30°로 온도가 조절된 분광 광도계에서 4~5분 동안 물에 대해 340nm에서 광학 밀도의 증가를 기록합니다. 곡선의 초기 선형 부분에서 분당 OD를 계산합니다(OD 테스트).

동시에 블랭크 비율(Δ #x394;OD 공백) 효소용액 대신 효소희석액을 첨가하는 것을 제외하고는 시험과 동일한 방법을 사용하였다.

*분석 직전에 효소 제제를 얼음처럼 차가운 효소 희석제(D)에 녹이고 동일한 완충액으로 0.05−0.20U/ml로 희석합니다.

계산

활동은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다:

  • 볼륨 활동(U/ml) =

  • ΔOD/ min(ΔOD 테스트−ΔOD 공백)×Vt×df

    6.22×1.0×Vs

  • = ΔOD/min×4.82×df

웨이트 활동(U /mg) = (U/ml)×1/C

< td class="w10p">6.22 td>

참조

1) A .Ishaque, M.Mihausen 및 HRLevy; 생화학. 생물 물리학. 결의안. Comm., 59, 894 (1974).

2) C. 올리브, ME Geroch 및 HRLevy; J.Biol.Chem., 246, 2043(1971).

3) M.Milhausen 및 HR Levy; Eur.J.Biochem., 50, 453 (1975).

4) ELCoe 및 L.-H.Hsu; 생화학. 생물 물리학. 결의안. Comm., 53, 66(1973).

5) C.Olive 및 HR Levy; Biochem., 6, 730 (1967).

6) RPMetzger, SA Metzger 및 RL Parsons; 아치바이오켐. Biophys., 149, 102(1972).

7) Methods in Enzymology, Vol, 1, p328(SPColowick 및 NOKapalan,eds.), Academic Press, New York(1955).

표 1. Effect of Various Chemicals on Glucose-6-phosphate dehydrogenase

[The enzyme dissolved in 50mM Tris-HCl buffer,pH 7.5 (5.25U/ml) was incubated with each at 30℃.]

Vt: 총 부피 (3.0ml)
Vs: 샘플량(0.1ml)
: NADH의 밀리몰 흡광계수(cm2/마이크로몰)
1.0: 빛의 경로 길이(cm)
df: 희석 계수
C: 용해 시 효소 농도(c mg/ml)
< th align="center" class="w20p">Chemical< /tr>< td align="left">98
Concn.(mM)Residual
activity(%)
None- 100
Metal salt2.0
AgNO3< /td>86
Ba(OAc)251
CaCl2 90
Cd(OAc)274
CoCl 280
CuSO 466
FeCl30
FeSO41
HgCl284
MgCl290
MnCl289
NiCl2 89
Pb(OAc)23
Zn(OAc)2 67
ZnSO453
KF2.0< /td>93
NaF20.0
NaN320.0< /td>93
  • < td align="left">0.1%
    ChemicalConcn.(mM)Residual
    activity(%)
    NEM2.091
    PCMB2.096
    MIA2.014
    Iodoacetamide2.00
    EDTA5.094
    (NH4) 2SO420.098
    Borate20.095
    o-Phenanthroline2.093
    α,α′-Dipyridyl2.095
    Urea2.093
    Guanidine2.093
    Hydroxylamine2.091
    Na-cholate1.0%102
    Triton X-1001.0%100
    Brij 351.0%4
    SDS0.1%0
    Tween 20 0.1%101
    Span 200.1%99
    DAC0

    • Ac, CH3CO; NEM, N-Ethylmaleimide; PCMB, p-Chloromercuribenzoate; MIA, Monoiodoacetate; EDTA, Ethylenediaminetetraacetate; SDS, Sodium dodecyl Dimethylbenzylalkylammoniumchloride.

    • Fig.1.Stability form)

      Fig.1. Stability (Powder form)

      (kept under dry conditions)

    • Fig.2. Stability (Powder form)

      Fig.2. Stability (Powder form)

      (kept under dry conditions)

    • Fig.3. Stability (Liquid form at 5℃)

      Fig.3. Stability (Liquid form at 5℃)

      enzyme concentration:5,000U/ml composition:3.2M ammonium sulfate,pH6.0

    • < p class="img imgAuto txtCenter">Fig.4. pH-Activity

      Fig.4. pH- 활동

      30℃ in the following buffer solution: pH5.7-6.8, 15mM Veronal-CH3COONaHCI;pH6.8-8.5,50mM Tris-HCI; pH8.5-9.5, 50mM glycine-NaOH

    • Fig .5. Temperature activity

      Fig.5. Temperature activity

      (in 50mM Tris-HCI buffer, pH7.8)< /p>

    • Fig.6. pH-Stability

      Fig.6. pH-Stability

      30℃, 17hr-treatment with the following buffer solution: pH5.0-7.8, 30mM VeronalCH3 COONa-HCI;pH7.5-8.5, 0.1M Tris-HCI; pH8.5-9.5,0.1M glycine-NaOH

    • Fig.7. Thermal stability

      Fig.7. Thermal stability

      30min-treatment with 5.0mM glycineNaOH buffer, pH8.0, containing 0.1% of bovine serum albumin

    활성 측정법(Japanese)

    1. 원리

    원리

    NADH의 생성량을 340nm의 흡광도 변화로 측정한다.

    2. 정의

    하기 조건으로 1분간에 1마이크로몰의 NADH를 생성하는 효소량을 1단위(U)로 한다.

    3. 시약

    • 55mM Tris-HCl 완충액, pH 7.8(3.3mM MgCl2 포함)
    • 60 mM NAD+ 수용액(사용시 준비)
    • 0.1 M G-6-P(glucose-6-phosphate ) 수용액 (용시 조제)

    효소 용액: 효소 표품을 미리 빙냉한 0.1% 소혈청 알부민(BSA)을 포함한 5mM Tris-HCl 완충액 , pH 7.5에서 용해시키고 분석 직전에 동일한 완충액으로 0.05 & # x301C; 0.20U / ml로 희석한다.

    4. 절차

    1. 하기 반응 혼합물을 큐벳(d=1.0cm)으로 제조 30 ~ 약 5 분간 예비 가온한다.

    < td class="w20p">(A)
    2.7mlTris-HCl 완충액
    0.1mlNAD+수용액(B)
    0.1ml기질 용액(C)

    2. 효소 용액 0.1ml를 첨가하고, 완만하게 혼화 후, 물을 대조에 30℃으로 제어된 분광 광도계로 340nm의 흡광도 변화를 4〜5분간 기록하고, 그 초기 직선 부분으로부터 분당 흡광도 변화를 구한다(ΔODtest).

    3. 맹검은 효소 용액 대신 효소 희석액 (0.1% BSA를 포함하는 5 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.5) 0.1ml를 첨가하고 상기와 동일한 조작을 행하여 1 분당 흡광도 변화를 구한다 (ΔODblank).

    5. 수식

    • U/ml=

    • ΔOD/min (ΔOD test−ΔOD blank)×3.0(ml)× 희석 배율

      6.22×1.0×0.1(ml)

    < /tr>
    = ΔOD/min×4.82×희석 배율
    U/mg= U/ml× 1/C
    6.22: NADH의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm2/micromole)
    1.0: 광로 길이(cm)
    C: 용해 시 효소 농도 (c mg/ml)

    문의하기

    생명과학 연구용 시약에 관한 궁금하신 점을 문의해주세요.
    빠른 시일 내에 답변드리겠습니다.