TOYOBO BIO

진단시약원료 효소

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준비 및 사양

< tbody>< td>등급II

성상	황색 무정형 분말, 동결건조
활동량	등급Ⅰ	180U/mg-solid 이상
	100U/mg-고체 이상
		(포함 안정제 약 50%)
오염물질	카탈라제	등급Ⅰ	≤5.0×10^-3%
오염물질		등급Ⅱ	≤3.0%
안정제	글루콘산칼륨, 글루타민산나트륨

속성

< div class="tableWrap Wrap">

안정성	안정적 −20℃ 최소 1년 동안(그림 1)
분자량	약. 153,000
미카엘리스 상수	3.3×10^-2M(β-D-글루코스),³⁾
미카엘리스 상수	6.1×10^-2 M(2-디옥시글루코스)
구조	2몰의 FAD를 포함하는 당단백질
억제제	p-클로로머큐리벤조에이트, 중금속 이온(Cu⁺⁺, Hg^{++< /sup>, Ag^＋)}
최적 pH	4.5(그림 3)
최적 온도	40− 50℃(그림 4)
pH 안정성	pH 4.5−6.0(30℃, 20시간)(그림 5)
열 안정성	50℃ 미만 (pH 5.7, 1시간)(그림 6)
기질 특이성	(표 1)
다양한 화학물질의 영향	(표 2)< /td>

애플리케이션

이 효소는 포도당의 효소적 측정에 유용하며, '-글루코시다아제(AGH-211)와 결합된 경우 아밀라아제 활성 분석에 유용합니다. 임상 분석에서는 말토올리고당 또는 변성 전분을 기질로 사용합니다.

분석

원칙

4-AA : 4-아미노안티피린

EHSPT : N-Ethyl-N-(2-hydroxy- 3-설포프로필)-m-톨루이딘

퀴노네이민 염료의 외관은 분광광도법으로 555nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 1개 단위는 분당 1마이크로몰의 과산화수소(퀴논이민 염료의 0.5마이크로몰)를 형성합니다.

방법

시약

A. MES-Na 완충액 pH 5.7	0.1M［2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산(MW=213.25) 2.13g을 ca. H2O 60ml를 넣고 25°C에서 1N NaOH로 pH를 5.7로 맞춘 후 H2O를 100ml까지 채운다.(5°에서는 안정) x2103; 한 달 동안)
B. 포도당 용액	15%[1.5g의 β-D-포도당을 녹인 후 H₂O로 10ml까지 채웁니다] 최소 2시간 동안 분석 전.) (신선하게 준비해야 함)
다. 4-AA 용액	0.5%[4-아미노안티피린(MW=203.25)/10ml의 H2O에 대해 50mg](5℃ 갈색 병에 담아 최소 1주일 동안 보관)
D. EHSPT 용액	40mM［N-에틸-N-(2-하이드록시-3-설포프로필)-m-톨루이딘 118mg(MW=295.3)/H10ml2 O] (5°C에서 갈색 병에 담아 최소 1주일 동안 안정함)
E. 과산화효소 용액	500U(푸르푸로갈린 단위)/ml of H₂O
F. 효소 희석제	10mM MES-Na 완충액, pH 5.7, 0.1% Triton X-100 함유

절차

1. 다음 작업 용액을 갈색 병에 준비하고 얼음 위에 보관하세요.

(신선하게 준비해야 함)
30ml	완충 용액	(A)
6ml	기질 용액	(B)
0.3ml	4-AA 솔루션	( C)
0.3ml	EHSPT 솔루션	( D)
0.3ml	POD 솔루션	( E)

< /tr>

분석 혼합물의 농도
MES 버퍼	79 mM
D-글루코스	131mM
4-AA	0.2mM
EHSPT	0.3mM
POD	약 4U/ml

2. 작업 용액 3.0ml를 큐벳(d=1.0cm)에 피펫팅하여 37°C에서 평형화합니다. 약 5분 동안.

3. 효소용액 0.1ml^*를 넣고 가볍게 뒤집어 섞어주세요.

4. 37°로 온도가 조절된 분광 광도계에서 2~3분 동안 물에 대해 555nm에서 광학 밀도의 증가를 기록하고 곡선의 초기 선형 부분에서 분당 OD를 계산합니다(&# x394;OD test).

동시에 효소희석액(F)을 제외하고는 시험과 동일한 방법을 이용하여 공시험률(ΔOD 공백)을 측정한다. 효소 용액 대신 첨가됩니다.

^*효소 제제를 얼음처럼 차가운 효소 희석제(F)에 녹여 희석합니다. 분석 직전에 동일한 완충액을 사용하여 0.05−0.2U/ml까지.

계산

활동량은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다.

활동량(U/ml) =
ΔOD/min (ΔOD 테스트−ΔOD 공백)×Vt×df
32.8×1/2×1.0×Vs
= & #x394;OD/min×1.89×df

체중 활동도(U/mg) = (U/ml)×1/C

< td class="w10p">Vs< td>: H₂O₂ 1몰이 퀴논이민 염료의 절반을 생성한다는 사실을 바탕으로 한 인수입니다.

Vt	: 총 용량(3.1ml)
: 샘플량(0.1ml)
32.8	: 분석 조건에서 퀴노네이민 염료의 밀리몰 흡광 계수(cm²/마이크로몰)
1/2
1.0	: 광선 길이(cm)
df	: 희석 인자
C	: 용해 시 효소 농도(c mg/ml)

참조

1) The Enzymes, Vol.ⅫB, P.421 (PDBoyer, ed.), Academic Press (1975).

2) 효소학 방법 , Vol.Ⅸ, p.82 (SPColowick 및 NOKaplan, ed.), Academic Press (1966).

3) BEPSwoboda 및 V.Massay ; J.Biol.Chem., 240, 2209(1965).

4) PJAuse, SLCook 및 JTMaloy; Anal.Chem., 47, 244(1975).

5) DCWilliams, GFHuff 및 WRGaitz; Clin.Chem., 22, 372(1976).

표 1. Substrate Specificity of Glucose oxidase

[0.1M of Substrate, 79mM MES buffer, pH 5.7, at 30℃ ]

Substrate (0.1M)	Relative activity(%)
D-Glucose	100
2-Dexy-D-glucose	16.2
Glucono-1,5-lactone	0.06
L-Glucose	0.00
Galactose	3.10
Mannose	2.10

Substrate (0.1M) Relative activity(%)
Fructose 0.24
Xylose 0.93
Ribose 0.00< /td>
Maltose 0.69
Lactose 0.00

Substrate (0.1M)	Relative activity(%)
Fructose	0.24
Xylose	0.93
Ribose	0.00< /td>
Maltose	0.69
Lactose	0.00

Table 2. Effect of Various Chemicals on Glucose oxidase

[The enzyme dissolved in 0.1M MES buffer, pH 5.7 (10U/ml) was incubated with each chemical for 2hr at #x2103;.]

< td align="left">
Chemical Concn.(mM) Residual
activity(%)
None - 100
Metal salt 2.0
MgCl₂ 92.6
CaCl₂ 93.6
BaCl₂ 94.4
CoCl₂ 98.1
MnCl₂ 95.1
ZnSO₂ 94.3
FeCl_{2< /sub>} 96.8
NiCl₂ 91.7
CuSO₄ 71.6
AgNO₃ 58.6
HgCl₂ 0.7
PCMB 2.0 31.6
MIA 2.0 96.8
NaF 2.0 97.1

Chemical	Concn.(mM)	Residual activity(%)
None	-	100
Metal salt	2.0
MgCl₂		92.6
CaCl₂		93.6
BaCl₂		94.4
CoCl₂		98.1
MnCl₂		95.1
ZnSO₂		94.3
FeCl_{2< /sub>}		96.8
NiCl₂		91.7
CuSO₄		71.6
AgNO₃		58.6
HgCl₂		0.7
PCMB	2.0	31.6
MIA	2.0	96.8
NaF	2.0	97.1

< /tr>< tr>< tr>

Chemical	Concn.(mM)	Residual activity( %)
NaN₃	20	96.3
EDTA	5.0	97.3
o-Phenanthroline	2.0	95.3
α,α′-Dipyridyl	2.0	99.5
Borate	50.0	96.1
IAA	2.0	96.1
MIA	2.0	101.1
Hydroxylamine	10.0	98.3
Sodium bisulfite	10.0	100.0
hydrazine	10.0	103.1
Triton X-100	0.1%	111.2
Brij 35	0.1%	108.0
Tween 20	0.1%	110.7
Span 20	0.1%	106.7
Na-Cholate	0.1%	106.1
SDS	0.1%	113.1

PCMB, p-Chloromercuribenzoate; MIA, Monoiodoacetate; EDTA, Ethylenediamimetetraacetate; IAA, Iodoacetamide; NEM, N-Ethylmaleimide; SDS, Sodium do p>

Fig.1. Stability (Powder form)
(kept under dry conditions)
그림 .2. Stability (Powder form)
(kept under dry conditions)
Fig.3. pH-Activity
37℃,5min-reaction in 79mM buffer solution : ○̶̶○ . acetate;●̶̶% MES;△̶̶△, BES;×̶̶×, BICINE
Fig.4. Temperature activity
(5min-reaction in 79mM MES buffer, pH5.7)
Fig.5. pH-Stability
30℃,20hr-treatment with 0.1M buffer solution : ○̶̶○ . acetate : ●̶̶● MES : △̶̶△, BES : ×̶̶×, BICINE
Fig.6. Thermal stability
(1hr-treatment in 79mM MES buffer , pH5.7)

활성 측정법(Japanese)

1. 원리

2. 정의

하기 조건 하에서 1분 동안 1 마이크로몰의 H₂O₂를 생성하는 효소량을 1단위(U)로 한다.

3. 시약

0.1M MES-Na 완충액, pH 5.7 (5℃ 저장 1 매달 사용 가능)
15% 포도당 용액(사용 전에 2시간 이상 방치한다)(용시 조제)
0.5% 4-AA 용액(갈색병 중 5&# x2103; 보존에 1주일 안정적으로 사용 가능)
40mM EHSPT (TOOS) 용액 용액

효소 용액 : 효소 표본을 미리 빙냉한 0.1% Triton X100을 포함하는 10mM MES-Na 완충액(A)에 용해시키고 분석 직전에 동일한 완충액으로 0.05〜0.2U/ml로 희석한다.

4. 절차

1. 갈색 병에 다음 반응 혼합물을 준비하고 얼음 냉각 보관 한다.

(사용시 준비)
30 ml	MES-Na 완충액	(A)
6 ml	기질 용액	(B)
0.3ml	4-AA 수용액	(C)
0.3ml	EHSPT(TOOS) 수용액	(D)
0.3ml	POD 수용액	(E)
(갈색 병에서 얼음 냉각 저장)

2. 반응 혼합물 3.0ml를 큐벳 (d = 1.0cm)에 분주하고 37 & # x2103;에서 약 5 분간 예비 가온한다.

3. 효소 용액 0.1ml를 첨가하여 서서히 혼화한 후, 물을 대조에 37℃로 제어된 분광 광도계로 555nm의 흡광도 변화를 2ĭC;3분간 기록하고, 그 직선 부분으로부터 분당 흡광도 변화를 구한다(ΔOD test).

4.맹검은 반응혼액①에 효소액 대신에 효소 희석액〔MES-Na 완충액(A)〕0.1ml를 또한, 상기와 같이 조작을 행하여, 1분간 당의 흡광도 변화를 구한다(ΔODblank).

5. 수식

U/ml =
ΔOD/min (ΔOD test−ΔOD blank)×3.1×df
32.8 ×1/2×1.0×0.1

	=ΔOD/min×1.89×df
U/mg	= U/ml×1/C
32.8	: Quinoneimine 염료의 상기 측정 조건 하에서 밀리몰 분자 흡광 계수(cm²/micromole)
1/ 2	: 산소 반응으로 생성된 H2O2의 1분자로 형성되는 Quinoneimine 색소는 1/2분자인 것에 의한 계수
1.0< /td>	: 광로 길이(cm)
C	: 용해시 효소 농도(c mg/ml)