진단시약원료 효소

GLUCOSE DEHYDROGENASE

준비 및 사양

성상백색 무정형 분말, 동결건조.
활동GradeⅢ 250U/mg-solid 이상
오염물질NADH 산화효소≤1.0×10-3%
α-글루코시다제≤1.0×10-3%
글루코스-6-인산염 탈수소효소≤1.0×10-3%

속성

안정성 −20℃에서 안정적 최소 1년 동안 (그림 1)
분자량 약. 101,000(겔 여과)
등전점 4.5
미카엘리스 상수 NAD+링크됨1.38×10-2M(D-글루코스) 3.09×10-4M(NAD+)
NADP+ 연결됨1.25×10-2M(D-글루코스) 4.07×10-5M(NADP+< /sup>)
억제제 Ag＋, Hg 2＋, 모노요오도아세트산
최적 pH 9.0 （ 그림 4)
최적 온도 55℃ (그림 5)
pH 안정성 pH 6.0−7.5(20℃, 16시간) (그림 6)
열 안정성 45℃ (50mM K-인산 완충액, pH 7.0으로 15분 처리)(그림 7)
기질 특이성 β-D-Glucose 또는 2-Deoxy-glucose에 특이적임(표.1)(NAD＋ 또는 NADP+는 보효소 역할을 합니다.)

응용

이 효소는 D-글루코스의 효소 측정에 유용합니다.

분석

원리

Principle

NADH의 모양은 분광광도법으로 340nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 하나의 단위는 분당 1마이크로몰의 NADH를 형성합니다.

방법

시약

아. Tris-HCl 완충액, pH 8.00.1M
B. D-글루코스 용액1.5M
C. β-NAD+ 용액80mg/ml
D. 효소 희석제50mM K-인산염 완충액, pH 7.0 contg. 0.1% BSA

절차< /h2>

1.다음 반응 혼합물을 큐벳(d=1.0cm)에 준비하고 37℃에서 평형화합니다. 약 5분 동안.

< td>(B)< /tr>
2.6mlTris- HCl 완충액, pH 8.0(A)
0.3ml기질 용액
0.1mlβ-NAD+ 용액(C)
분석 혼합물의 농도
Tris-HCl 완충액85.25mM
D-글루코스147.54mM
NAD+3.66mM

2.효소 용액* 0.05ml를 첨가하고 가볍게 뒤집어 섞습니다.

3.37℃으로 온도가 조절되는 분광 광도계에서 2~5분간 물에 대한 340nm에서의 광학 밀도 증가를 기록하고 계산합니다. 곡선의 초기 선형 부분에서 분당 OD(OD 테스트).
동시에 동일한 방법을 사용하여 공백률(OD 공백)을 측정합니다. 효소용액 대신 효소희석제(D)를 첨가하는 것을 제외하고는 시험으로 사용한다.

*효소를 녹인다 얼음처럼 차가운 효소 희석제(D)에 준비하고, 동일한 완충액으로 0.8−1.2U/ml로 희석한 후 얼음 위에 보관하세요.

계산

활동은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다:

  • 볼륨 활동(U/ml) =

  • ΔOD/min(ΔOD 테스트 −ΔOD 공백)×Vt×df

    6.22×1.0×Vs

  • = ΔOD/min×9.807×df

체중 활성도(U/mg) = (U/ml )×1/C

< tr>
Vt: 총 용량(3.05ml)
Vs: 시료량(0.05ml)
6.22: NADH의 밀리몰 흡광계수 분석 조건(cm2/마이크로몰)
1.0: 광선 길이(cm)
df: 희석 인자
C: 용해 시 효소 농도(c mg/ ml)

표 1. 포도당 탈수소효소의 기질 특이성

  • < tr>< tr>
    기질(150mM)상대 활성도(%)
    D-포도당100.0
    L-포도당0.0
    D-자일로스16.2
    2-데옥시-글루코스127.0
    L-소르보스0.0
    D-만노스5.1
    D-과당0.0
    • < li class="mt20">
    기판(150mM)상대활성도(%)
    갈락토스1.7< /td>
    D-유당1.5
    D-소르비톨0.0< /td>
    D-만니톨0.0
    자당0.0
    이노시톨0.0
    말토스1.4

표 2. Effect of Various Chemicals on Glucose dehydrogenase

[The enzyme dissolved in 50mM K-phosphate buffer, pH 7.0 (2.8U/ml) was incubated with each chemical for 1hrat1 .]

  • < th align="left">100
    ChemicalConcn.(mM)Residual
    activity(%)
    None-
    Metal salt2.0
    AgNO37.1
    Ba(OAc)2< /sub>98.2
    CaCl298.9
    Cd(OAc)296.6
    CoCl296.4
    CuSO 499.5
    FeCl3 98.1
    FeSO496.6< /td>
    HgCl25.9
    MgCl2101.5
    MnCl2100.9
    NiCl2 93.4
    Pb(OAc)299.8
    ZnSO4102.1
  • ChemicalConcn.(mM)Residual
    activity(%)
    KF 2.098.7
    NaF10.0100.6
    NaN3 20.0101.6
    NEM2.097.6
    MIA2.00.4
    IAA2.092.2
    EDTA5.0107.2
    (NH4)2SO420.096.0
    Borate20.0101.4
    o-Phenanthroline2.0 97.7
    α,α′-Dipyridyl1.0100.3
    Urea2.0122.5
    구아니딘 2.099.2
    Hydroxylamine2.0107.2

Ac, CH3CO; NEM, N-Ethylmaleimide; MIA, Monoiodoacetate; IAA, lodoacetamide; EDTA, Ethylenediaminetetraacetate.

  • Fig.1. Stability (Powder form)

    (kept under dry conditions)

  • Fig.2. Stability (Powder form)

    Fig.2. Stability (Powder form)

    (kept under dry conditions)

  • Fig.3. Stability (Liquid form)

    그림 .3. Stability (Liquid form)

    25℃,in 83mM Tris-HCI buffer solutionpH8.0(contg.3.7mM β-NAD,40U/ml mutarotase )enzyme concn.:300U/ml

  • Fig. 4. pH-Activity

    Fig.4. pH-Activity

    37℃,5min-reaction in 80mM buffer solution
    ●:pH6.0-8.0 K-phosphate
    ○:pH8.0-9.0,Tris-HCI
    ■:pH8.5-10.5 Carbonate

    >

  • Fig.5. Temperature activity

    Fig.5. Temperature activity

    (in 80 mM Tris-HCI buffer, pH8.0)

  • Fig.6. pH-Stability

    Fig.6. pH-Stability

    20℃,16hr with 0.1M buffer solution
    ●:pH4.0-6.0 acetate
    ○:pH6.0-8.0 K-phosphate
    ■:pH7.5-9.0 Tris-HCI
    □:pH8.5-10.5 carbonate
    enzyme concn.:10U/ml

  • Fig.7. Thermal stability

    Fig.7 Thermal stability

    15min-treatment with 50mM K-phosphate buffer pH7.0 enzyme concn.: 12U/ml

활성 측정법(Japanese)

1. 원리

2. 정의

하기 조건 하에서 1분에 1 마이크로몰의 NADH를 생성하는 효소량을 1단위(U) 한다.

3. 시약

  • 0.1M Tris-HCl 완충액, pH 8.0
  • 1.5M D-Glucose 수용액
  • 80mg/mlNAD+ 수용액 (용 시간 준비)

효소 용액 : 효소 표제를 미리 얼음 냉각 된 0.1 % BSA를 함유하는 50mMK- 인산 완충액, pH 7.0에서 용해시키고 분석 직전 같은 완충액으로 0.8-1.2U/ml로 희석.

4. 절차

1. 하기 반응 혼합물을 큐벳(d=1.0cm)으로 제조 그런 다음 37 ~ 5 분 동안 예비 가온한다.

< td align="center">(B)
2.6mlTris-HCl 완충액(A)
0.3mlD-포도당 수용액
0.1mlNAD+ 수용액(C)

2. 효소 용액 0.05ml 부드럽게 혼합 한 후 물을 대조군으로 제어 한 분광 광도계로 340nm의 흡광도 변화를 5 분간 기록하고, 그 2 ~ 5 분의 직선 부분에서 1 분당 흡광도 변화 (ΔODtest).

3. 맹검은 효소 용액 대신에 효소 희석액(인산 완충액, pH 7.0)을 0.05ml 첨가하고, 상기와 같이 조작을 실시하여 1분간 당의 흡광도 변화를 구한다. (ΔODblank)

5. 수식

  • U/ml =

  • ΔOD/min (ΔOD test−ΔOD blank)×3.05×희석 배율

    6.22×1.0×0.05

= ΔOD/min×9.807×희석 배율
U/mg =U/ ml×1/C
6.22: NADH의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm2/micromole)
1.0: 광로 길이(cm)
C: 용해 시 의 효소 농도 (c mg/ml)

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