진단시약원료 효소

β-GALACTOSIDASE

준비 및 사양

< /tr>
외관백색 무정형 분말, 동결건조.
활동GradeII 500U/mg-solid 이상
오염물질α-갈락토시다제＜1×10-4%
α-글루코시다제 ＜1×10-4%
β-글루코시다제＜2×10-3%
α ;-만노시다제＜1×10-4%
β-만노시다제＜1×10-4%
단백질분해효소＜10mAbs/mg -P
안정기Mg＋＋

속성

< td> 50℃ 미만 (pH 7.3, 15분) (그림 5)
안정성 −20℃에서 안정적 최소 1년 동안 (그림 1)
분자량 540,000 1,2)
등전점 3) 4.6
미카엘리스 상수 3.0×10-4M (o-Nitrophenyl-β -D-갈락토사이드), 6.7×10-5M(pNitrophenyl-β-D-갈락토사이드), 2.3×10-4sup>M(페닐- β-D-갈락토사이드), 2.5×10-3M(유당)
구조 4 〜8) 효소는 약 135,000의 분자량을 갖는 4개의 동일한 하위 단위로 구성됩니다. 아미노산 분석은 하위 단위당 약 1,170개의 잔기를 나타냅니다. E 280nm1cm (1%)=20.9 1cm
억제제 p-클로로머쿠리벤조에이트, 로도아세트아미드, 중금속 이온(Zn++, Fe+++, Cd++, Cu++, Pb++, Ag+, Hg++), 이온성 세제(SDS, DAC 등)
최적 pH 7.0−7.5 (그림 2)
최적 온도 50−55℃ (그림 3)
pH 안정성 pH 6.5−8.5 ( 25℃, 20시간) (그림 4)
열 안정성
기질 특이성 이 효소는 -D-갈락토실 결합을 특이적으로 가수분해합니다(표 1).
다양한 화학물질의 영향 ( 표 2)

응용 분야

이 효소는 탄수화물의 구조 조사, 유당 측정(식품 분석) 및 효소 면역 분석을 위한 효소 라벨로 유용합니다.

분석

원칙

Principle

o-니트로페놀의 외관은 분광광도법으로 410nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 1개 단위는 분당 1마이크로몰의 ONP를 형성합니다.

방법

시약

아. 인산염 완충액, pH 7.30.1M (0.1M Na2HPO4와 0.1M KH2를 혼합하여 준비) PO4는 37℃에서 pH 7.3에 도달합니다.)
B. 메르캅토에탄올 용액3.36M[2-메르캅토에탄올(14.2M) 4.0ml를 H2O로 17ml로 희석합니다.] (신선하게 준비해야 함)
다. MgCl2 용액30mM (MgCl2・6H2O 610mg을 H 약 80ml에 녹입니다.) 2O, 1.0N NaOH로 pH를 7.3으로 조절한 후 H2O를 100ml까지 채운다.)
디. ONPG 용액34mM(205mg ONPG/20ml 시약 A)(0−5℃에서 보관하면 1주일 동안 안정함)
E. 효소 희석제50mM 인산염 완충액, pH 7.3 contg. 1.0mM MgCl2 및 0.1% BSA

절차

1.다음 반응 혼합물을 큐벳(d=1.0cm)에 준비하고 37℃ 약 5분 동안.

(A)
2.5ml0.1M 인산염 완충액, pH 7.3
0.1ml메르캅토에탄올 용액< /td>(B)
0.1mlMgCl2 용액(C)
0.2mlONPG 솔루션(D)
< tr>
분석 혼합물의 농도
인산염 완충액92mM
ONPG2.3mM
메르캅토에탄올0.11M
MgCl2< /sub>1.0mM

2.효소 용액* 0.1ml를 첨가하고 가볍게 뒤집어 섞습니다

3.37°로 온도 조절된 분광 광도계에서 물에 대해 2~3분간 410nm에서 광학 밀도의 증가를 기록하고 곡선의 초기 선형 부분에서 분당 OD를 계산합니다(ΔOD 테스트). ).
동시에 효소용액 대신 효소희석액(E)을 첨가하는 것을 제외하고는 시험과 동일한 방법을 이용하여 바탕율(ΔOD 바탕)을 측정한다.

*얼음처럼 차가운 효소 희석제(E)를 사용하여 효소 제제를 0.17−0.85U/ml로 희석합니다.

< /div>

계산

활동은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다.

  • 볼륨 활동(U/ml) =

  • ΔOD/min (ΔOD 테스트−ΔOD 공백)×Vt×df

    3.5×1.0×Vs< /p>

  • = ΔOD/min×8.57×df

<테이블 클래스 ="mt10">Vt: 총 용량(3.0ml)Vs: 시료량(0.1ml)3.5: 분석 조건에서 ONP의 밀리몰 흡광계수(cm2 /micromole)1.0: 빛의 경로 길이(cm)df: 희석 인자

참조

1) GRGraben, E.Steers, Jr. 및 CBAnfinsen; J.Biol.Chem., 240, 2468(1965).

2) CCContaxis 및 FJReithel; Biochem,J., 124, 623(1971).

3) K.Wallenfels 및 R.Weil; 효소, Vol. 7, p.617 (PDBoyer ed.), Academic Press. 뉴욕-런던(1972).

4) A.Ulmann, MEGoldberg, D.Perrin 및 J.Monod; Biochemistry, 7, 261(1968).

5) AVFowler 및 I.Zabin; J.Biol.Chem., 245, 5032(1970).

6) AVFowler 및 I.Zabin; J.Biol.Chem., 247, 5425, 5432(1972).

7) F.Melchers 및 W.Messer; Eur.J.Biochem., 34, 228(1973).

8) KELangley, AVFowler 및 I.Zabin; J.Biol.Chem., 250, 2587(1975).

표 1. Substrate Specificity of β-Galactosidase

  • < tr>< th align="center" class="w20p">Vmax**
    (Relative value)< td>1.1
    Substrate (2.3mM)Relative
    activity(%)
    o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside100100
    p-Nitrophenyl-β -D-galactopyranoside14.713.4
    Phenyl-β-D-galactopyranoside*1.3
    Lactose*2.13.9
    p-Nitrophenyl-α-D-galactopyranoside00
    p -Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside00
    p-Nitrophenyl-β- D-glucopyranoside00
  • Substrate (2.3mM )Relative
    activity(%)    		Vmax**< /sup>
    (Relative value)
    p-Nitrophenyl-α-D-mannopyranoside 00
    p-Nitrophenyl-β-D-mannopyranoside0 0
    p-Nitrophenyl-α-L-fucopyranoside00
    p-Nitrophenyl-β-L-fucopyranoside00
    p -Nitrophenyl-α-D-xylopyranoside00
    p-Nitrophenyl-β- D-xylopyranoside00

* Liberation of galactose was measured using galactose dehydrogenase as a coupling enzyme.
**Vmax was obtained from Lineweaver-Burk plots (Vmax with o-Nitrophenyl-β-D-gal0pymol of hydrolyzed substrate per min per mg-protein).

Table 2. Effect of Various Chemicals on β-Galactosidase< /h2>

[This enzyme dissolved in 50mM PIPES buffer, pH 7.0(10U/ml) was incubated with each chemical at 30℃ for 30minutes. The residual activity was described above.]

  • < tr>< /tr>
    • ChemicalConcn.(mM)Residual
    activity(%)
    None-100
    Metal salt2.0
    MgCl299
    CaCl2 102
    Ba(OAc)280
    FeCl3 59
    CoCl283
    MnCl2100
    ZnSO46.2
    Cd(OAc)24.7
    NiCl277
    CuSO40.9< /td>
    Pb(OAc)21.3
    AgNO30
    HgCl22.0
    Mercaptoethanol2.099
    Cysteine2.0102
    PCMB2.00.3
    < th align="center" class="w20p">Chemical< tr>
    Concn.(mM)Residual
    activity(%)
    MIA2.086
    NEM2.095
    IAA 2.01.4
    Hydroxylamine2.078
    EDTA5.0103
    o-Phenanthroline2.099
    α,α′-Dipyridyl2.0103
    Borate5098
    NaF 2.099
    NaN32098
    Triton X-1000.1%101
    Brij 35< /td>0.1%103
    Tween 200.1%103< /td>
    Span 200.1%107
    Na-cholate< /td>0.1%109
    SDS0.05%75
    DAC0.05%0

Ac, CH3CO; PCMB, p-Chloromercuribenzoate; MIA, Monoiodoacetate; NEM, N-Ethylmaleimide; IAA, lodoacetamide;<
EDTA, Ethylenediaminetetraacetate; SDS, Sodium dodecyl sulfate; DAC, Dimethylbenzylalkylammonium chloride.

  • Fig.1. Stability (Powder form)

    Fig.1. Stability (Powder form)

    (kept under dry conditions)

  • Fig.2. pH-Activity

    Fig.2. pH-Activity

    37℃,15 min-reaction in BrittonRobinson buffer

  • Fig.3. Temperature activity

    Fig.3. Temperature activity

    15min-reaction in 0.1M phospate buffer, pH7.3

  • Fig.4. pH-Stability

    Fig.4. pH-Stability

    25℃,20hr-treatment with BrittonRobinson buffer

  • Fig.5. Thermal stability

    Fig.5. Thermal stability

    15min -treatment with 50mM phosphate buffer,pH7.3 contg. 1.0mM MgCl2 enzyme concn.:80U/ml

활성 측정법(Japanese)

1. 원리

원리

o-Nitrophenol의 생성량을 410nm의 흡광도 변화로 측정한다.

2. 정의

하기 조건에서 1분에 1마이크로몰의 o-Nitrophenol을 생성하는 효소량을 1단위 (U )로 한다.

3. 시약

  • 0.1M 인산염 완충액, pH 7.3(37℃)(0.1M Na2HPO4 용액과 0.1M KH2PO4 용액을 혼합하여 37℃ pH를 7.3으로 제조한다. li> 30mM MgCl 2 용액 (610mg의 MgCl 2 · 6H 2 O를 약 80ml의 증류수에 용해시킨 후, 1.0N NaOH로 pH를 7.3으로 조정하고 증류수로 100ml로한다) 34mM ONPG 용액 (205mg의 ONPG를 20ml의 시약 A에 교반 용해시킨다)
    • ="txt_14">효소 용액: 효소 표제를 미리 빙냉한 1.0mM MgCl2, 0.1% BSA를 포함하는 50mM 인산 완충액, pH 7.3에서 0.17~0.85U/ml로 희석한다.

    4. 절차

    1. 하기 반응 혼합물을 큐벳(d=1.0cm)으로 제조 37 ~ 약 5 분간 예비 가온한다.

    2.5ml0.1M 인산염 완충액, pH7.3(A)
    0.1ml메르캅토에탄올 용액< /td>(B)
    0.1mlMgCl2용액(C)
    0.2mlONPG 용액( D)

    2. 효소 용액 0.1ml를 첨가하고 완만하게 혼화 후, 물을 대조에 37℃로 제어시킨 분광광도계로 410nm의 흡광도 변화를 2~3분간 기록하고, 그 초기 직선 부분으로부터 1분간당의 흡광도 변화를 구한다(ΔODtest) .

    3.맹검은 효소 용액 대신에 효소 희석액(1.0mM의 MgCl2)을 포함하는 50mM 인 산 완충액, pH 7.3)을 0.1ml를 가하고, 상기와 같이 조작을 행하여 1분간 당의 흡광도 변화를 구한다(ΔODblank).

    5. 수식

    • U/ml =< /p>

    • ΔOD/min (ΔOD test−ΔOD blank)×3.0(ml) × 희석 배율

      3.5×1.0×0.1(ml)

    = ΔOD/min×8.57×희석 배율
    3.5: o-Nitrophenol의 상기 측정 조건 하에서 밀리몰 분자 흡광 계수(cm2/micromole)
    1.0: 광로 길이(cm )

문의하기

생명과학 연구용 시약에 관한 궁금하신 점을 문의해주세요.
빠른 시일 내에 답변드리겠습니다.