진단시약원료 효소

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준비 및 사양

< table class="darkGray"> 외관 황색 무정형 분말, 동결건조 활동 GradeⅢ 500U/mg-solid 이상 오염물질 미오카나아제 ≤5.0×10-1% NADH 산화효소≤1.0×10-1%

응용 프로그램

이 효소는 NAD(P)H 및 NAD(P)H의 수소 수용체 역할을 하는 다양한 염료와 결합하면 많은 탈수소효소가 생성됩니다.

분석

< div class="mb30">

원칙

Principle

DCPIP(2,6-di클로로페놀-인도페놀)의 환원은 분광광도법을 통해 600 nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 1단위는 분당 1마이크로몰의 DCPIP를 감소시킵니다.

< /div>

방법

시약

A. 완충액0.2M Tris-HCl, pH 8.0
B. NADH 용액36mM(갓 준비하여 얼음 위에 보관)
다. DCPIP 용액2.4mM[7.8mg DCPIP(Mw:326.11)/10ml of H2O](신선하게 준비해야 함)
디. 효소 희석제Tween20 0.5% 함유 완충 용액(A)

절차

1.큐벳에 다음 반응 혼합물을 준비합니다( d=1.0cm) 37℃에서 평형화합니다. 약 4분 동안.

2.4mlH2O
0.3ml완충 용액(A)
0.1mlNADH 용액(B)
분석 혼합물의 농도
트리스 버퍼27mM
NADH1.2mM
DCPIP 80μM
Tween20약 167μg/ml

2.효소 용액* 0.1ml를 첨가하고 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 37℃에서 평형을 이루세요. 1분간 더 기다리세요.

3.DCPIP 용액(C) 0.1ml를 넣고 빠르게 뒤집어 섞으세요.

4.37°로 온도 조절된 분광 광도계에서 물에 대해 3~4분 동안 600nm에서 광학 밀도의 감소를 기록하고 OD를 계산합니다. (OD test) 곡선의 초기 선형부분으로부터 분당 분당 반응속도를 측정한다.
동시에 효소용액 대신 효소희석액을 첨가하는 것을 제외하고는 시험과 동일한 방법으로 바탕율(OD 바탕)을 측정한다.

*얼음처럼 차가운 완충액(A)(약 1.0% 용액)에 효소 제제를 녹이고 희석합니다. 얼음처럼 차가운 효소 희석제(D)를 넣어 0.10−0.25U/ml로 만들고 얼음 위에 보관하세요.

계산

활동량은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다.

  • 활동량(U /ml) =

  • ΔOD/min (OD 테스트−OD 공백)×Vt×df

    20.9×1.0×Vs

= ΔOD/min×1.43×df< /p>

체중활동량(U/mg) = (U/ml)×1/C

Vt: 총 용량(3.0ml)
Vs: 샘플 용량(0.1ml)
20.9: 분석 조건에서 DCPIP의 밀리몰 흡광 계수(cm2/마이크로몰)
1.0: 광선 길이(cm)
df: 희석 계수
C: 용해 시 효소 농도(c mg/ml)

표 1. 다양한 화학물질이 다이아포라제에 미치는 영향

［0.1에 용해된 효소 M HEPES 완충액, pH 7.5(5U/ml)를 각 화학물질과 함께 25°C에서 배양했습니다. 1시간 동안.]

  • < /tr>< /tr>
    화학농도(mM)잔류 활성(%)< /th>
    없음-100
    금속염2.0
    MgCl2102
    CaCl299
    Ba(OAc)2100
    FeCl 34.4
    CoCl2 94
    MnCl255< /td>
    ZnCl284
    Cd(OAc)2101
    NiCl2101
    CuSO4 23
    Pb(OAc)246
    AgNO394
    MIA1.0104
    NaF2.0105
  • < td>o-페난트롤린< td>IAA< td>0.05%
    화학물질농도(mM)잔류 활동량(%)
    NaN32.0< /td>104
    EDTA5.0105
    2.0105
    α,α'-디피리딜1.0< /td>102
    붕산염5.0104
    2.0105
    NEM2.0106
    히드록실아민2.0107
    TritonX-1000.10%109
    브리지 350.10%109
    트윈 200.10%116
    스팬 200.10%113
    Na-콜린0.10%110
    SDS0.05%91
    DAC110
< div class="p txt_14">MIA, 모노요오도아세테이트; EDTA, 에틸렌디아민테트라아세테이트; IAA, 요오도아세트아미드; NEM, N-에틸말레이미드; SDS, 나트륨 도데실 황산염; DAC, 염화디메틸벤질암모늄

  • 그림 1. 안정성(분말 형태)

    그림 1. 안정성(분말 형태)

    (건조한 조건에서 보관)

  • 그림 2. 안정성(분말 형태)

    그림 2. 안정성(분말 형태)

    (건조한 조건에서 보관)

  • 그림 3. pH-활성도

    그림 3. pH-활성

    37℃, in 0.1M 완충액;〇――〇, KPB; △―― △, Tris-HCl; ―― , Gly-NaOH

  • 그림 4. pH-안정성

    그림 4. pH-안정성

    25℃, 0.1M 완충액으로 20시간 처리; 〇――〇, 글리신-HCl;▲――▲, 아세트산; ―― , KPB; ―― , Tris-HCl; ×――×, 글리신-NaOH

  • 그림 5. 온도 활동

    그림 5. Temperature activity

    (in 50mM K-Phoshate buffer, pH7.5)

  • Fig.6. Thermal stability

    Fig.6. Thermal stability

    15 min-treatment with 0.1M K-Phosphate buffer, pH7.5 Enzyme concentration : 10 U/ml

활성 측정법(Japanese)

1. 원리

원리

DCPIP(2,6-dichlorophenol-indophenol)의 환원량을 600nm의 흡광도 변화로 측정한다.

2. 정의

하기 조건 하에서 1분간에 600nm의 흡광도를 1.0 감소시키는 효소량을 1단위(U)로 한다.

3. 시약

  • 0.2M Tris-HCl 완충액, pH8.0
  • 36mM NADH 수용액(용시 조제, 빙냉 보존)
  • 2.4mM DCPIP 수용액[7.8mg의 DCPIP(Mw:326.11)을 10ml의 증류수로 용해한다](용시 조제)

효소 용액: 효소 표제를 미리 빙냉된 증류수에 용해시키고, 분석 직전에 효소 희석액(D)으로 0.10~0.25U/ml로 희석한다.

4. 절차

1. 아래 반응액을 큐벳 (d = 1.0cm)로 채취하고, 25℃로 약 5분간 예비 가온한다.

2.4ml증류수
0.3ml0.2M Tris-HCl 완충액, pH 8.0(시약 A)
0.1ml36mM NADH 수용액(시약 B)

2. 효소 용액 0.1ml를 첨가하여 피펫팅에 의한 혼화 후, 추가로 약 1분간 예비 가온한다.

3. DCPIP 수용액(시약 C)을 0.1ml 가하고, 신속하게 전도 혼화한 후, 물을 대조에 37℃ 에 제어된 분광광도계로 600nm의 흡광도 변화를 3~4분간 기록하고, 그 초기 직선 부분으로부터 1분간당의 흡광도 변화를 구한다(ODtest).

4. 맹검은 1의 반응 혼합액에 효소 희석액(0.5%의 Tween20을 포함하는 시약 A), DCPIP 수용액 각 0.1ml를 또한, 상기와 동일하게 조작하여 1 분당 흡광도 변화량을 구한다 (ODblank).

5. 수식

  • U/ ml =

  • ΔOD/min (OD test-OD blank)×3.0(ml)×희석 배율

    20.9×1.0×0.10(ml)

< tr>
= ΔOD/min×1.43×희석 배율
U/mg=U/ml×1/C< /td>
20.9: DCPIP의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm2/micromole)
1.0: 광로 길이(cm)
C: 용해시 효소 농도(c mg /ml)

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