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준비 및 사양
(안정제 약 15% 함유)
속성
| 안정성 | −20℃에서 안정적 최소 1년 동안(그림 1) |
|---|---|
| 분자량 | 24,000 1) |
| 미카엘리스 상수 | 2.0×10-5 M(NADH),6.0×10-6M(NADPH) |
| 구조 | 1몰 효소 몰당 FMN의 1) |
| 억제제 | N-에틸말레이미드 | < /tr>
| 최적 pH | 8.5(그림 3) | 최적 온도 | 50℃(그림 4) |
| pH 안정성 | pH7.5(30℃, 3시간)(그림 5) |
| 열적 안정성 | 30℃(pH 7.5, 30분) 미만(그림 6) |
| 기질 특이성 | NADH 또는 NADPH를 환원제로 사용할 수 있습니다. 촉매 비율(NADPH/ NADH)는 분석법에서 0.6이다. 산소나 시토크롬 C는 모두 수소 수용체로 활용될 수 없습니다. |
응용
이 효소는 다양한 염료와 결합 시 NAD(P)H 및 많은 탈수소효소의 비색 측정에 유용합니다. NAD(P)H로부터 수소 수용체 역할을 합니다.
ASSAY
원칙
DCPIP(2,6-di클로로페놀-인도페놀)의 환원은 분광광도법을 통해 600 nm에서 측정됩니다.
단위 정의
아래 설명된 조건에 따라 1단위는 분당 DCPIP의 1단위 흡광도(1.0)를 감소시킵니다.< /p>
방법
시약
< div class="tableWrap Wrap">| A. 완충액 | 0.2M Tris-HCl, pH 7.5 |
|---|---|
| B. NADH 용액 | 6.0mM (신선하게 준비하여 얼음에 보관) |
| 다. DCPIP 용액 | 1.2mM[3.9mg DCPIP・2H2O/10ml of H2O](신선하게 준비해야 함) |
| 디. 효소희석제 | 소혈청알부민 0.1%를 함유한 완충용액(A) |
절차
1.다음 반응 혼합물을 준비합니다. 큐벳(d=1.0cm)을 넣고 25°C에서 평형화합니다. 약 5분 동안.
| 2.4ml | H2O | |
|---|---|---|
| 0.3ml | 완충 용액 | (A) |
| 0.1ml | NADH 용액 | (B) |
| 분석 혼합물의 농도 | |
|---|---|
| 트리스 버퍼 | 27mM |
| NADH | 0.20mM |
| DCPIP | 40μM |
| BSA | ca.33μg/ml |
2.효소 용액*과 DCPIP 용액을 각각 0.1ml 첨가합니다( C) 이 순서대로 넣고 빠른 반전으로 혼합합니다.
3.2~3분 동안 물에 대해 600nm에서 광학 밀도의 감소를 기록합니다. 분광 광도계를 25°로 온도 조절하고 곡선의 초기 선형 부분으로부터 분당 OD를 계산합니다(OD 테스트).
동시에 블랭크 비율(&# x394;OD 공백) 효소 용액 대신 효소희석액을 첨가하는 것을 제외하고는 시험과 동일한 방법을 사용하였다.
* 효소 제제를 얼음처럼 차가운 완충액(A)(약 1.0% 용액)에 녹이고 얼음처럼 차가운 효소 희석제(D)를 사용하여 0.4−0.8U/ml로 희석한 후 얼음 위에 보관합니다.
계산
활동은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다:
볼륨 활동(U/ml) =
ΔOD/min (ΔOD 테스트−ΔOD 공백)×df
1.0×Vs
= ΔOD/min×10×df
체중 활동량(U/mg) = ( U/ml)×1/C
| Vs | : 시료량(0.1ml)< /td> |
| 1.0 | : 단위 정의로 인한 600nm에서의 단위 흡광도 |
| df | < td>: 희석 인자|
| C | : 용해 시 효소 농도(c mg/ml) |
참조
1)F.Kaplan, P.Setlow 및 NOKaplan; Arch,Biochem.Biophys., 132, 91 (1969).
표 1. 다양한 화학물질이 Diaphorase에 미치는 영향
［0.2M Tris-HCl 완충액, pH 7.5(40U/ml)에 용해된 효소를 각 화학물질과 함께 25°C에서 배양했습니다. 1시간 동안.]
< !-- /tableWrap -->화학 농도(mM) 잔류 활성(%)< /th> 없음 - 100 금속염 2.0 MgCl2 99 CaCl2 102 Ba(OAc)2 100 FeCl 2 90 CoCl2 101 MnCl2 96< /td> ZnCl2 100 Cd(OAc)2 100 NiCl2 99 CuSO4 87 Pb(OAc)2 88 < /tr>AgNO3 103 HgCl2 103 PCMB 2.0 90 MIA 1.0 100 화학 농도(mM) 잔류 활성(%)< /th> NaF 2.0 102 NaN3 2.0 100 EDTA 5.0< /td> 99 o-페난트롤린 2.0 99 α,α′-디피리딜 1.0 101 붕산염 5.0< /td> 100 IAA 2.0 99 < td>NEM 2.0 100 히드록실아민 2.0 101 TritonX-100 0.10% 106 Brij 35 0.10% 104 트윈 20 0.10% 107 스팬 20 0.10% 101 Na-Cholate 0.10% 99 SDS 0.05% 32< /td> DAC 0.05% 32
그림 1. 안정성(분말 형태)
(건조한 조건에서 보관)
그림 2. 안정성(분말 형태)
(건조한 조건에서 보관)
그림 3. pH-활성
효소 반응은 NADH(◯) 또는 NADPH( )를 사용하여 수행되었습니다. 사용된 버퍼: pH6.0-7.5, 10mM Veronal-acetate;pH7.5-9.0 , 33mM Tris-HCI;pH9.2-10.2, 33mM NH4OH-NH4OH
그림 4. Temperature activity
The enzme reaction was carried out with NADH(◯)or NADPH( ).
20mM Tris-HCI buffer,pH8.5
그림 5. pH-Stability
30℃,3hr-treatment with the following buffer solution: pH6.0-7.5, 10mM Veronalacetate; pH7.5-9.0, 33mM Tris-HCI
Fig.6. Thermal stability
30min-treatment with 0.2M Tris-HCI buffer,pH7.5 enzyme concentration:40U/ml
활성 측정법(Japanese)
1. 원리
DCPIP (2,6-dichlorophenol-indophenol)의 환원량을 600nm의 흡광도 변화로 측정한다.
2. 정의
하기 조건 하에서 1분간에 600nm의 흡광도를 1.0 감소시키는 효소량을 1단위(U)로 한다.
3. 시약
- 0.2M Tris-HCl 완충액, pH7.5
- 6.0 mM NADH 수용액 (용시 조제, 빙냉 보존) 용해한다](용시 조제)
효소 용액: 효소 표품을 미리 빙냉한 시약 A에 용해하고(약 1.0% 용액), 미리 빙냉 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 시약 A로 0.4-0.8U / ml로 희석하고 빙냉 보관한다.
4. 절차
1. 아래 반응액을 큐벳 (d = 1.0cm)로 채취하고, 25℃로 약 5분간 예비 가온한다.
| 2.4ml | 증류수 | (A) |
| 0.3ml | Tris-HCl | (B) |
| 0.1ml | NADH 수용액 | (C) |
2. 효소 용액, DCPIP 수용액(C) 각 0.1ml를 이 순서로 첨가하고, 완만하고 신속하게 혼합한 후, 물을 대조에 25℃로 제어되었다 분광광도계로 600nm의 흡광도 변화를 2~3분간 기록하고, 그 초기 직선 부분으로부터 1분간 당의 흡광도 변화를 구한다(ΔODtest).
3.맹검은 반응혼액 1에 효소 희석액(0.1%BSA를 포함하는 시약 A), DCPIP 수용액(C) 각 0.1ml 를 첨가하고, 상기와 같이 조작을 행하여 1분간 당의 흡광도 변화를 구한다(ΔODblank).
5. 수식
U/ ml =
ΔOD/min (ΔOD test−ΔOD blank)×희석 배율
1.0×0.1(ml)
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