진단시약원료 효소

< img src="/inday_fileinfo/img/v520240422194449.">

준비 및 사양

< table class="darkGray"> 외관 백색 무정형 분말, 동결건조 활동성 GradeⅢ 10U/mg-solid 이상
(안정제 약 30% 함유) ) 오염물질 크레아티닌 아미도가수분해효소 ≤1.0× 10-2% 크레아틴 아미디노가수분해효소 ≤1.0×10-2% 우레아제 ≤1.0×10-2% NADH 산화효소 ≤1.0×10-2% NH4+ ≤1.0×10-2μg/u 안정기 만니톨

속성

안정성 −20℃에서 안정적 최소 1년 동안 (그림 1)
분자량 대략. 260,000
등전점4.4
미카엘리스 상수3.5×10-3M(크레아티닌)
구조6개의 하위 단위
억제제 Ag＋,Hg＋＋,o-phenanthroline,monioodoacetate
최적 pH8.5−9.5(그림. 3)
최적 온도65-75℃(그림 .4)
pH 안정성pH 7.0−11.0(30℃, 20시간)(그림 5)
열 안정성65℃ 미만 (pH 7.5, 1시간)(그림 6)
다양한 화학물질의 영향 (표 1)
< h2 class="ttl_bigLine">응용

이 효소는 임상에서 글루타메이트 탈수소효소(GTD-211, GTD-209, GTD-309)와 결합하여 크레아티닌을 효소적으로 측정하는 데 유용합니다. 분석.

분석

원리< /h2>

Principle

GIDH:글루타메이트 탈수소효소(NADP+ 의존)[L-글루타메이트:NADP 산화환원효소(탈아미노화),(EC 1.4.1.4 .)]
NADPH의 소멸은 분광 광도법으로 340nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 1개 단위는 분당 1마이크로몰의 암모니아(NADPH 마이크로몰의 산화)를 형성합니다.

방법

시약

< 번째 align="왼쪽">D. GIDH 용액
아. 크레아티닌 용액50mM(크레아티닌 565.5mg/50mM K-인산염 완충액 100ml, pH7.5)
B. NADPH 용액3.0mM (27.2mg NADPH・Na4・4H2O/50mM K-인산염 완충액 10ml, pH7.5)( 신선하게 준비해야 함)
다. α-케토글루타레이트 용액10mM (α-케토글루타르산 14.6mg/50mM K-인산염 완충액 10ml, pH7.5)(신선하게 준비해야 함)
약 1,000U/ml[Toyobo GradeII 희석(Tris-HCl 완충액, 암모니아가 없고 H2O가 포함되어 약 1,000U/ml까지)]
E. 효소 희석제50mM K-인산염 완충액, pH 7.5

절차

1.큐벳에 다음 반응 혼합물을 준비합니다(d= 1.0cm) 37℃에서 평형을 이룹니다. 약 5분간 담가주세요.

2.4ml기질 용액(A)
0.3mlNADPH 용액(B)
0.3mlα-케토글루타레이트 용액(C)
0.05mlGIDH 솔루션(D)
< tr>
분석 혼합물의 농도
K-인산염 완충액49 mM
크레아티닌38mM
α-케토글루타레이트0.95mM
NADPH0.29mM
GIDH약 16U/ml

2.효소 용액* 0.10ml를 첨가하고 가볍게 뒤집어 섞습니다.

3. 37°로 온도가 조절된 분광 광도계에서 3~4분 동안 물에 대해 340nm에서 광학 밀도의 감소를 기록하고 곡선의 초기 선형 부분에서 분당 OD를 계산합니다(OD 테스트). ).
이와 동시에 효소용액(ΔOD 공백) 대신 효소희석액을 첨가하는 것을 제외하고는 시험과 동일한 방법을 이용하여 공백율을 측정한다.

*효소 제제를 얼음처럼 차가운 효소 희석제(E)에 녹이고 동일한 완충액으로 0.15−0.4U/ml로 희석합니다. 분석.

계산

활동은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다.< /p>

  • 볼륨 활동(U/ml) =

  • ΔOD/min (ΔOD 테스트−ΔOD 공백)×Vt×df

    6.22×1.0×Vs

= ΔOD/min×5.06×df

체중활동량(U/mg) = (U/ml)×1/C

Vt: 전체 용량(3.15ml)
Vs: 샘플 용량(0.10ml)
6.22: NADH의 밀리몰 흡광계수(cm2/마이크로몰)
1.0 : 빛의 경로 길이(cm)
df: 희석 계수
C: 용해시 효소 농도(c mg/ml)

참조

1)J.Szulmajster; Biochim.Biophys.Acta, 30, 154(1958).

2)T.Uwajima 및 O.Terada; Agr.Biol.Chem., 40, 1055 (1976).

3)T.Uwajima 및 O.Terada; Agr.Biol.Chem., 41, 339 (1977).

4)D.Tsuru; Rinsho Kensa, 22, 1331(1978).

5)TWEsders 및 SYLynn; J.Biol.Chem., 260, 3915 (1985).

표 1. 크레아티닌 탈이미나제에 대한 다양한 화학물질의 영향

[50mM Tris-HCl 완충액, pH 7.5(2U/ml)에 용해된 효소를 25°C에서 배양했습니다. 각 화학물질에 대해 2시간 동안. The residual activity was assayed according to the routine method described above.]

  • < /tr>< td>NiCl2< /tr>
    ChemicalConcn.(mM)Residual activity(%)
    None-100
    Metal salt1.0
    MgCl2103.8
    CaCl2 100.6
    Ba(OAc)2105.7
    FeCl35.0
    CoCl2108.2
    MnCl2179.0
    ZnSO4100.0
    Cd(OAc)2143.0
    103.2
    CuSO4< /td>2.1
    Pb(OAc)287.3
    AgNO31.1
    HgCl21.6
    2-Mercaptoethanol1.096.8
    PCMB0.191.1
  • < td>1.0
    ChemicalConcn.(mM)Residual activity(%)
    MIA1.00.6< /td>
    NEM1.086.1
    IAA60.1
    Hydroxylamine1.086.1
    EDTA2.096.2
    o-Phenanthroline1.00.7
    α,α′-Dipyridyl0.1100.6
    Borate5.098.7
    NaF1.0 100.6
    NaN31.099.4
    Triton X-1001.0%95.6
    Brij 350.1%83.5
    Span 200.5%103.2
    Na-cholate0.5%100.0
    SDS 0.5%101.0
    DAC0.5%81.8
Ac, CH3CO ; PCMB, p-Chloromercuribenzoate; MIA, Monoiodoacetate; NEM, N-Ethylmaleimide; IAA, Iodoacetamide;EDTA, Ethylenediaminetetraacetate; SDS, Sodium dodecyl sulfate; DAC, Dimethylbenzylalkylammonium >

Fig.1. Stability (Powder form)

Fig.1. Stability (Powder form)

(kept under dry conditions)

  • Fig.2. Stability (Powder form)

    Fig.2. Stability (Powder form)

    (kept under dry conditions)

  • Fig.3. pH-Activity

    Fig.3. pH-Activity

    37℃ in Britton-Robinson buffer The activity was assayed by the indophenol method.3)

  • Fig.4. Temperature activity

    in 50mM K-phosphate buffer, pH 7.5; The acitivity was assayed by the indophenol method.3)

  • Fig.5. pH-Stability

    Fig.5. pH-Stability

    30℃, 20hr-treatment with Britton-Robinson buffer

  • Fig.6. Thermal stability

    Fig.6. Thermal stability

    1hr-treatment with 50mM K-phosphate buffer, pH7.5

    • 활성 측정법(Japanese)

    1. 원리

    원리

    NADPH의 소실량은 340nm에서의 흡광도 변화로 측정한다.

    2. 정의

    하기 조건 하에서 1분에 1 마이크로몰의 암모니아를 생성하는 효소량을 1 단위 (U) 한다.

    3. 시약

    • 50mM 크레아티닌 용액(565.5mg의 크레아티닌을 50mM K-phosphate buffer, pH7.5 100ml (용시 준비)
    • 3.0mM NADPH 용액(27.2mg NADPH·Na4·4H2O를 50mM K-phosphate buffer, pH 7.5 10ml에 용해) (사용시 제조)
    • 10mM α- 케토글루타르산 용액 (14.6mg의 α- 케토글루타르산을 50mM K-phosphate buffer, pH 7.5 10ml에 용해) )
    • 글루탐산 탈수소효소(GIDH) 용액 [Tris-HCl 완충액(암모니아를 함유하지 않는 동양방제 GIDH는 본 활성 측정에 적합함)을 약 1,000 U/ml에 증류수로 희석하여 사용]

    효소 용액: 효소 표품을 미리 빙냉한 50mMK-phosphate buffer, pH7.5로 용해하고, 분석 직전에 같은 완충액으로 0.15 ~ 0.4U/ml로 희석한다.

    4. 절차

    1. 아래 반응 혼합물을 큐벳 (d = 1.0cm)로 준비하고 약 5 분 동안 예비 가온한다.

    2.4ml기질 용액(A)
    0.3mlNADPH 용액(B)
    0.3mlα-케토글루타르산 용액(C)
    0.05ml GIDH 용액

    2. 효소 용액 0.1ml 를 첨가하고, 완만하게 혼화 후, 물을 대조에 37℃에 제어된 분광 광도계로 340nm의 흡광도 변화를 3~4분간 기록하고, 그 초기 직선 부분으로부터 1분간당의 흡광도 변화를 구한다 (ΔODtest).

    3.맹검은 반응혼액1에 효소 용액 대신에 효소 희석액(50mM K-phosphate buffer, pH 7.5)을 0.1ml 또한, 상기와 같이 조작하여 1 분당 흡광도 변화를 구한다 (ΔODblank).

    5. 수식

    • U/ ml =

    • ΔOD/min (ΔOD test−ΔOD blank)×3.15 (ml)×희석 배율

      6.22×1.0×0.10(ml)

    = ΔOD/min×5.06×희석 배율
    U/mg= U/ml×1/C
    6.22: NADPH의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm2/micromole)< /td>
    1.0: 광로 길이(cm)
    C: 용해시 효소 농도(c mg/ml)

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