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진단시약원료 효소

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< img src="/inday_fileinfo/img/v520240422194449.">

준비 및 사양

< table class="darkGray">외관백색 무정형 분말, 동결건조활동성GradeⅡ(−211) 450U/mg-고체 이상
GradeⅢ(−311) 150U/mg- 고체 이상오염물질NADH 산화효소≤5.0×10^-2%카탈라제≤2.0%안정제자당, BSA

속성

< td>대략. 175,000 ¹⁾

분자량
안정성	−20℃에서 안정적 최소 1년 동안 (그림 1,2)
등전점	4.7 ³⁾
미카엘리스 상수	3.2×10^-2M(크레아티닌), 5.7×10^{- 2}M(크레아틴)
구조	효소 분자당 6개의 하위 단위(1개의 아연이 각 하위 단위에 결합되어 있음) ³⁾
억제제	Ag^＋,Hg^＋＋,N-브로모숙신이미드, EDTA
최적 pH	6.5−7.5 （그림 5）
최적 온도	70℃（ 그림 6)
pH 안정성	pH 7.5−9.0(5℃, 16시간)(그림 7)
열 안정성	70℃ 미만 (pH 7.5, 30분)(그림 8)
다양한 금속의 영향	(표 1)

< h2 class="ttl_bigLine">응용 프로그램

이 효소는 크레아틴 아미디노가수분해효소(CRH-211, CRH-221, CRH-229) 및 사르코신 산화효소와 결합하여 크레아티닌을 효소적으로 측정하는 데 유용합니다. (SAO-351) 임상 분석.

분석

원칙

Principle

크레아티닌-피크레이트(Jaffe의 반응에 따른 주황색 염료)의 출현은 분광광도법을 통해 520nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 1단위는 분당 1마이크로몰의 주황색 염료를 형성합니다.

방법

시약

A. 크레아틴 용액	0.1M [크레아틴 1.49g(Nacalai tesque)/50mM 인산염 완충액 100ml, pH 7.5](신선하게 준비해야 함)
B. NaOH 용액	0.5N
다. 피크르산 용액	1.0%(W/V)
D. 효소 희석제	50mM 인산염 완충액, pH 7.5

절차

1.기질용액(A) 1.0ml를 피펫으로 넣어 시험액에 넣습니다. 튜브를 사용하여 37℃에서 평형을 유지합니다. 약 5분 동안.

2.효소액* 0.1ml를 넣고 섞어주세요.

< p class="txt_14 numList mb20">3.37°에서 정확히 10분 후, 즉시 반응 용액의 분취량(0.1ml)(1/11 부피)을 2.0ml의 반응 용액에 옮깁니다. NaOH 용액(B).

4.1.0ml의 피크르산 용액(C)을 추가하고 25℃에서 배양합니다. 20분 동안.

5.물에 대해 520nm에서 광학 밀도를 측정합니다(OD 테스트).
동시에 준비 얼음처럼 차가운 기질용액에 효소용액을 첨가한 직후 반응액 0.1ml를 NaOH용액(2.0ml)에 옮겨 공시험(blank)하고, 시험과 동일한 방법을 실시한다(과정 4, 5). (OD 공백).

^*효소 제제를 얼음처럼 차가운 50mM 인산염 완충액(pH 7.5)에 녹이고 희석합니다. 동일한 완충액으로 1.8−2.4U/ml, 분석 직전.

계산

활동량은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다:

활동량(U/ml) =
ΔOD/min (OD 테스트−OD 공백)×Vt×11×df
< p class="txt_14">4.65×1.0×t×Vs

= ΔOD×7.33×df

< p class="txt_14">체중활동량(U/mg) = (U/ml)×1/C

분석 혼합물의 농도
인산염 완충액	45mM
크레아틴	90mM

< tr>

Vt	: 총 용량(3.1ml)
Vs	: 샘플 용량(0.1ml)
4.65	: 크레아티닌-피크레이트(주황색 염료)의 밀리몰 흡광계수(cm²/마이크로몰)
11	: 반응액량(1.1ml)/샘플링량(0.1ml)
1.0	: 빛의 경로 길이(cm)
t	: 반응 시간(10분)
df	: 효소용액의 희석배수
C	: 용해시 효소농도(c mg/ml)

참조

1)D.Tsuru; Nucleic Acid and Amino Acids, 35, 31(1977).

2)D.Tsuru; Rinsho Kensa, 22, 1331(1978).

3)K.Rikitake, I.Oka, M.Ando, T.Yoshimoto 및 D. 쓰루; J.Biochem., 86, 1109(1979).

4)K.Yamamoto, M.Oka, T.Kikuchi 및 S.Emi; Biosci. 생명공학. Biochem., 59 (7), 1331 (1995).

표 1. 크레아티닌 아미도가수분해효소에 대한 다양한 금속의 영향

［50mM K-인산염 완충액(pH 7.5)에 용해된 효소를 각 금속(0.2mM)과 함께 25℃에서 30분 동안 배양했습니다.]

< /tr>
금속 잔여 활동(%)
없음 100
FeSO< sub>4 91.0
FeCl₃ 93.0
HgCl₂ 1.4
Zn(OAc)_{2< /sub>} 79.9
Cu(OAc)₂ 22.7
Ca(OAc)₂ 96.8
MnCl₂ 94.0
금속 잔여 활동도(%)
MgCl₂ 82.8

NiCl₂ 82.8
CoSO₄ 78.5
BaCl₂ 71.2
Pb (OAc)₂ 88.0
AgNO₃ 0
CdCl₂ 80.0

금속	잔여 활동(%)
없음	100
FeSO< sub>4	91.0
FeCl₃	93.0
HgCl₂	1.4
Zn(OAc)_{2< /sub>}	79.9
Cu(OAc)₂	22.7
Ca(OAc)₂	96.8
MnCl₂	94.0

금속	잔여 활동도(%)
MgCl₂	82.8
NiCl₂	82.8
CoSO₄	78.5
BaCl₂	71.2
Pb (OAc)₂	88.0
AgNO₃	0
CdCl₂	80.0

Ac, CH₃CO.

그림 1. 안정성(CNH-211)(분말 형태)
(건조한 조건에서 보관)
< img src="/inday_fileinfo/img/v520240422194449." alt="그림 2. 안정성(CNH-311)(분체형)">
그림 2. 안정성(CNH-311)(분말 형태)
(건조한 조건에서 보관)
< img src="/inday_fileinfo/img/v520240422194449." alt="그림 3. 안정성(분말 형태)">
그림 3. 안정성(분말 형태)
(건조한 조건에서 보관)
그림 4. 안정성(액체 형태)
(50 mM Tris-HCI 완충액 pH7.5에서)
그림 5. pH-활성
37℃, 50mM 완충 용액에서 10분 반응: pH5.5,아세테이트;pH6.0-8.0,인산염;
pH8.5-9.0 ,탄산염
< p class="ttl">그림 6. 온도 활동
50mM 인산염 완충액, pH7.4에서 10분간 반응
그림 7. pH-안정성
50mM 완충액으로 25℃16시간 처리: pH6.0-8.0,인산염; pH8.5-9.0, 탄산염
그림 8. 열 안정성
50mM 인산염 완충액, pH7.4로 30분 처리

< div class="sectionBlock04 mb30">

活性測정법(일본어)

1. 원리

생성한 크레아티닌을 알칼리성 하 피크린산과 반응시켜 생긴 오렌지 색소를 비색 정량한다.

2. 정의

하기 조건 하에서 1분에 1 마이크로몰의 오렌지 색소를 생성하는 효소량을 1 단위 (U )로 한다.

3. 시약

0.1M 크레아틴 용액[1.49g의 크레아틴(나카라이테스크제)을 50mM 인산 완충 액 pH7.5에 용해하고, 100ml로 한다](용시 조제)
0.5N NaOH 용액(2.0g의 NaOH를 증류수에 용해하여 100ml로 한다)

1.0% 피크르산 용액 (1.0g의 피크르산을 증류수에 용해시켜 100ml로 한다) 산 완충액, pH 7.5에서 용해시키고 분석 직전에 동일한 완충액으로 1.8-2.4U / ml로 희석한다.

4. 절차

1. 시험관에 기질 용액 (A) 1.0ml를 채취하고, 37℃에서 약 5분간 예비가온한다.

2. 효소 용액 0.1ml를 첨가하여 반응을 개시한다.

3.37℃로 정확하게 10분간 반응시킨 후, 즉시 반응액 0.1ml(1/11용량)를 채취, 미리 준비된 NaOH 용액 (B) 2.0ml에 첨가한다.

4.피크린산 용액(C)을 1.0ml 첨가하고, 25℃로 20분간 방치한 후, 520nm에서의 흡광도를 측정한다( ODtest).

5. 맹검은 빙냉 기질 용액에 효소 용액을 첨가한 직후 반응액의 0.1ml를 채취하고, NaOH 용액(2.0ml) 에 추가하여 준비한다. 이하의 순서 4를 조작하여 흡광도를 측정한다 (ODblank).

5. 수식

U/ ml =
ΔOD(OD test-OD blank)×3.1(ml)×11×희석 배율
4.65×1.0×10(분)×0.1(ml)

< td>1.0

	= ΔOD×7.33×희석 배율
U/mg	=U/ml×1 /C
4.65	: Creatinine-picrate(Orange dye)의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm²/micromole)
11	: 반응액 용량(1.1ml)/채취액량(0.1ml)
: 광로 길이(cm)
C	: 용해 시 효소 농도(c mg/ml)