진단시약원료 효소

< img src="/inday_fileinfo/img/v520240422194449.">

준비 및 사양

< table class="darkGray"> 외관 백색 무정형 분말, 동결건조 활동성 GradeⅡ 6.0U/mg-solid 이상
(안정제 약 50% 함유) 오염물질NADH 산화효소 ≤5.0×10-2%카탈라제≤2.0% 안정제 설탕, EDTA

속성

th>
안정성−20℃에서 안정적 최소 1년 동안(그림 1,2)
분자량 약. 100,000
등전점4.6±0.1
미카엘리스 상수1.9×10-2M(크레아틴)
구조효소 분자당 2개의 하위 단위
억제제
Cu++,Hg++,Ag+
최적 pH8.0(그림 4)
최적 온도40℃(그림 5)
pH 안정성pH 5.5−9.0(25℃, 16시간)(그림 6)
열 안정성50℃ 미만 (pH 7.5, 30분)(그림 7)
다양한 효과 화학물질(표 1)

응용 프로그램

이 효소는 크레아티닌 아미도가수분해효소(CNH-211, CNH-311)와 결합될 때 크레아틴 및 크레아티닌의 효소적 측정에 유용합니다. 임상 분석에서 사르코신 산화효소(SAO-351).4)

분석

원칙

Principle

요소와 p-디메틸아미노벤즈알데히드(DAB)(Ehrlich 반응)의 응축으로 형성된 노란색 염료의 외관은 분광광도법으로 435nm에서 측정됩니다.

단위 정의

1개 단위는 다음 조건에서 분당 1마이크로몰의 노란색 염료를 형성합니다. 아래에 설명되어 있습니다.

방법

시약< /h2>
A. 크레아틴 용액0.1M [크레아틴 1.49g(Nacalai tesque)/50mM 인산염 완충액 100ml, pH 7.5](신선하게 준비해야 함)
B. DAB 용액DAB 2.0g을 디메틸설폭사이드 100ml에 녹이고 이 용액에 농축액 15ml를 첨가합니다. HCl 용액.
C. 효소 희석제50mM 인산염 완충액, pH 7.5

절차

1.기질용액(A) 1.0ml를 피펫으로 넣어 시험액에 넣습니다. 튜브를 사용하여 37℃에서 평형을 유지합니다. 약 5분 동안.

2.효소액* 0.1ml를 넣고 섞어주세요.

< p class="txt_14 numList mb20">3.37°에서 정확히 10분 후 DAB 용액(B) 2.0ml를 추가하여 반응을 중지합니다.

4.25℃에서 배양합니다. 20분 동안.

5.물에 대해 435nm에서 광학 밀도를 측정합니다(OD 테스트).
동시에 준비 먼저 기질용액을 37℃에서 10분 동안 배양한 후 DAB용액 2.0ml와 혼합한 후 효소용액을 첨가하여 시험과 동일한 과정을 수행한다(과정 4 및 5)(OD 공백).

*효소 제제를 얼음처럼 차가운 효소 희석제(C)에 녹여 2.0~3.0으로 희석합니다. U/ml, 동일한 완충액, 분석 직전.

계산

활동 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다:

  • 부피 활동(U/ml) =

    < /li>

  • ΔOD(OD 테스트−OD 공백)×Vt×df

    0.321×1.0×t×Vs

= ΔOD×9.65×df

체중활동량(U/mg) = (U/ml)×1/C

분석 혼합물의 농도
인산염 완충액 50mM
크레아틴90mM
< /tr>
Vt: 전체 용량(3.1ml)
Vs: 샘플 용량(0.1ml)
0.321: 황색 염료의 밀리몰 흡광계수(cm2/마이크로몰)
1.0: 빛의 경로 길이(cm)
t: 반응 시간(10분)
df: 희석 인자
C: 용해 시 효소 농도(c mg/ml)

참조

< span>1)D.Tsuru; Nucleic Acid and Amino Acids, 35, 31(1977).

2)T.Yoshimoto, I.Oka 및 D.Tsuru; Arch.Biochem.Biophys., 177, 508 (1976).

3)T.Yoshimoto, I.Oka 및 D.Tsuru; J.Biochem., 79, 1381(1976).

4)D.Tsuru; Rinsho Kensa, 22, 1331(1978).

표 1. 다양한 화학물질이 크레아틴 아미디노가수분해효소에 미치는 영향

［효소 50mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5(80U/ml))에 용해시킨 후 25°C에서 배양했습니다. 각 화학물질을 30분 동안 사용하세요.]

  • < tr>< td>< td>104
    화학농도(mM)잔류 활성 (%)
    없음-100
    금속염1.0
    CaCl2107
    MnCl2109
    MgCl2103
    NiCl2107
    CoCl2108
    Ba(OAc)2
    Cd(OAc)288
    FeCl3103
    FeSO 4102
    HgCl2 2.7
    ZnSO497
    CuSO411
    Pb( OAc)2108
    AgNO32.5
    EDTA2099
    α,α′-디피리딜1.0100
  • < td>10< td>0.5%< /tr>
    화학농도(mM)잔류 활성(%)
    NaF1.0105
    PCMB< /td>0.333.3
    MIA1.0106
    IAA1.0103
    NaN3 10106
    o-페난트롤린1.0108< /td>
    하이드록실아민1.0105
    NEM0.3
    트리톤 X-1000.5%94
    브릿 350.5%103
    트윈 20100
    스팬 200.5%106
    나콜레이트0.5%103
    SDS0.25%102
    DAC0.5%1.7
Ac, CH3CO; EDTA, 에틸렌디아민테트라아세테이트; PCMB, p-클로로머쿠리벤조에이트; MIA, 모노요오도아세테이트;
IAA, 로도아세트아미드; NEM, N-에틸말레이미드; SDS, 나트륨 도데실 황산염; DAC, 염화디메틸벤질암모늄.

  • 그림 1. 안정성(분말 형태)

    그림 1. 안정성(분말 형태)

    (건조한 조건에서 보관)

  • 그림 2. 안정성(분말 형태)

    그림 2. 안정성(분말 형태)

    (건조한 조건에서 보관)

  • 그림 3. 안정성(액체 형태)

    그림 3. Stability (Liquid form)

    (in 50 mM K-phosphate buffer,pH7.5)

  • Fig.4. pH-Activity

    Fig.4. pH-Activity

    37℃ ,10min-reaction in 50mM K-phoshate buffer

  • Fig.5. Temperature activity

    Fig.5. Temperature activity

    10min-reaction in 50mM K-phosphate buffer, pH7.5

  • Fig.6.pH-Stability

    Fig.6.pH-Stability

    25℃ 16hr-treatment with 50mM buffer solution: pH4.0-5.5,Acetate pH6.0- 9.0, K-phosphate

  • Fig.7. Thermal stability

    Fig.7. Thermal stability

    30min-treament with 50mM K-phosphate buffer, pH7.5

활성 측정법(Japanese)

1 원리

원리

생성된 요소의 p- 디메틸 아미노 벤즈 알데히드 (DAB)와의 축합 (Ehrich 반응) 생성물 (황색 염료)을 비색 정량한다.

2. 정의

하기 조건 하에서 1분에 1 마이크로몰의 황색 색소를 생성하는 효소량을 1 단위(U )로 한다.

3. 시약

  • 0.1M 크레아틴 용액[1.49g의 크레아틴(나카라이테스크제)을 50mM 인산 완충 액 pH 7.5에 용해시켜 100ml로한다] (용시 조제)
  • DAB 용액 (2.0g의 p- 디메틸 아미노 벤즈 알데히드를 100ml의 디메틸 술폭 시드에 용해시킨 후, 진한 염산 15ml를 추가)

효소 용액 : 효소 표본을 미리 얼음으로 차가운 50mM 인산염 완충액, pH 7.5에 용해시키고 분석 직전에 동일한 완충액으로 2.0 ~3.0U/ml로 희석한다.

4. 절차

1. 시험관에 기질 용액 (A) 1.0ml를 채취하고, 37℃에서 약 5분간 예비가온한다.

2. 효소 용액 0.1ml를 첨가하여 반응을 개시한다.

3.37℃에서 정확하게 10분간 반응시킨 후, DAB 용액(B) 2.0ml를 첨가하여 반응을 정지시킨다 . 25분간 방치한 후, 435 nm에서의 흡광도를 측정한다(ODtest).

5. 맹검은 기질 용액(A) 1.0ml를 37℃로 10분간 방치한 후 DAB 용액(B) 2.0ml 를 첨가하여 혼화시킨 후, 효소 용액 0.1ml를 첨가하여 조제한다. 이하 마찬가지로 25분간 방치 후 흡광도를 측정한다(ODblank).

5. 수식

  • U/ ml =

  • ΔOD(OD test-OD blank)×3.1(ml)×희석 배율

    0.321×1.0×10(분)×0.1(ml)

< td>= ΔOD×9.65×희석 배율
U/mg=U/ml×1/C
0.321: 황색 염료의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm2/micromole)
1.0: 광로 길이(cm)
C: 용해시 효소 농도( c mg/ml)

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