진단시약원료 효소

< img src="/inday_fileinfo/img/v520240422194449.">

준비 및 사양

< table class="darkGray"> 외관 황색 무정형 분말, 동결건조 활동성 GradeⅢ 10U/mg-solid 이상
(안정제 약 20% 함유) 오염물질 카탈라아제 ≤1.0×102% 안정제 EDTA, BSA, 아미노산(글리신, 글루타민산나트륨 등)< /tbody>

속성

에 공유 결합되어 있습니다.
안정성−20℃에서 안정적 최소 1년 동안 (그림 1)
분자량 대략. 95,000
등전점4.1±0.1
미카엘리스 상수2.84×10-3M(콜린), 5.33×10-3M(베타인 알데히드)
구조1 mol의 FAD가 1 mol의 효소 8)
억제제 p-클로로머쿠리벤조에이트, Cu＋＋,Co＋＋,Hg＋＋,Ag＋
최적 pH8.0−8.5(그림 4)
최적 온도40−45℃(그림 5)
pH 안정성pH 7.0−9.0(30℃, 2시간 )(그림 6)
열 안정성37℃ 미만 ; (pH 7.5, 10분)(그림 7)
다양한 화학물질의 영향 (표 1)
< h2 class="ttl_bigLine">응용

이 효소는 포스포리파제 D와 결합 시 인지질의 효소 측정 및 임상 분석에서 콜린 에스테라제 활성에 유용합니다.9〜11 )

분석

원칙

Principle

퀴노네이민 염료의 외관은 분광광도법으로 500nm에서 측정됩니다.

단위 정의

아래 설명된 조건에서 1개 단위는 분당 1마이크로몰의 과산화수소(퀴논이민 염료의 0.5마이크로몰)를 형성합니다.

< /div>

방법

시약

< /tr>< tr>
A. 염화콜린 용액2.1%[염화콜린 2.1g/Tris-HCl 완충액(D) 100ml](신선하게 준비해야 함)
B. 4-AA 용액1.0%(4-아미노안티피린 1.0g/H2O 100ml)(갈색병에 4℃ 보관)
C. 페놀 용액1.0%(페놀 1.0g/H2O 100ml)(갈색 병에 담아 4°C에 보관)
디. Tris-HCl 완충액0.1M Tris-HCl 완충액, pH 8.0 [Tris(MW=121.14) 12.1g을 약 800ml의 H2O에 녹이고 조정한 후 25℃에서 pH를 8.0으로; 2.0N HCl의 경우 H2O로 최대 1,000ml를 채웁니다.]
E. 효소 희석제10mM Tris-HCl 완충액, pH 8.0 contg. 2mM EDTA 및 1.0% KCl.

조작

1.사용 전 다음의 작업액(100ml)을 갈색빛으로 준비하고 갈색병에 얼음보관하세요 .

97ml기질 용액(A)< /td>
1.0ml4-AA 용액(B)
2.0ml페놀 용액(C)
5.0mg과산화효소 고추냉이
(110 퍼푸로갈린 단위/mg)
(Toyobo GradeIII)
< thead>< td align="right">0.14M
분석 혼합물의 농도
트리스 완충액97 mM
염화콜린
EDTA33μM
KCI2.2 mM
4-아미노안티피린< /th>0.48mM
페놀2.1mM
PODca.4.92U/ml

2.작업 용액 3.0ml를 큐벳(d=1.0cm)에 피펫팅하여 평형화합니다. 37℃ 약 5분 동안.

3.효소 용액* 0.05ml를 첨가하고 가볍게 뒤집어 섞습니다.

4.37°로 온도 조절된 분광 광도계에서 작업 용액에 대해 3~4분 동안 500nm에서의 광학 밀도 증가를 기록하고 당 OD를 계산합니다. 곡선의 초기 선형 부분으로부터 1분 후.

*효소 제제를 얼음처럼 차가운 Tris-HCl 완충액에 녹입니다. (D) 효소 희석제(E)를 사용하여 0.1−0.5U/ml로 희석합니다.

계산

활동량은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다:

  • 활동량(U/ml) ) =

  • ΔOD/min×Vt×df

    12.0×1/2×1.0×Vs

= ΔOD/min×10.17×df

체중 활동량(U/mg) = (U/ml)×1/C

Vt : 총 용량(3.05ml)
Vs: 샘플 용량(0.05ml)
12.0: 분석 조건에서 퀴노네이민 염료의 밀리몰 흡광 계수(cm2/micromole)
1/2: H2O2 1몰이 퀴논이민 염료 0.5몰을 생성한다는 사실을 바탕으로 한 인수입니다.
1.0: 광선 길이(cm)
df: 희석 계수
C: 용해 시 효소 농도(c mg/ml)

참조

1)PJG Mann 및 JHQuastel; Biochem.J.,31, 869(1937).

2)PJG Mann 외; Biochem.J.,32, 1024(1938).

3)HSShieh; Can.J.Microbiol., 10, 837(1964).

4)HSShieh; Ibid., 11, 375 (1965).

5)GJJKortstee; Arch.Mikirobiol., 71, 235 (1970).

6)S.Ikuta, K.Matuura, S.Imamura, H.Misaki, Y.호리우티; J.Biochem., 82, 157(1977).

7)S.Ikuta, S.Imamura, H.Misaki 및 Y.Horiuti; J.Biochem., 82, 1741(1977).

8)M.Ohta-Fukuyama, Y.Miyake, S.Emi 및 T. 야마노; J.Biochem., 88, 197(1980).

9)M.Takayama 외; 클린. 침. Acta, 79, 93(1977).

10)K.Sugawara 및 A.Kihara; Eisei Kensa, 27(1), 106(1978).

11)H.Okabe 외; Clin.Chim.Acta, 80, 87(1977).

표 1. Effect of Various Chemicals on Choline oxidase

[The enzyme dissolved in 10mM Tris-HCl buffer, pH 8.0 contg. 2mM EDTA and 1.0% KCl (5U/ml) was incubated with at 25℃ for 1hr.]

  • < /table>
    • ChemicalConcn.(mM)Residual activity(%)
    None-100
    Metal salt2.0
    MgCl2 87
    CaCl292< /td>
    Ba(OAc)289
    FeCl387
    CoCl289
    MnCl2 91
    ZnCl288
    CdCl292
    NiCl2< /sub>91
    CuSO492
    Pb(OAc)287
    AgNO380
    HgCl 248
    2-Mercaptoethanol2.090
    PCMB1.013
    < tr>< td>95< td>92< td>96
    ChemicalConcn.(mM)Residual activity (%)
    MIA2.087
    NEM2.0100
    IAA2.0
    Hydroxylamine2.077
    EDTA< /td>5.092
    o-Phenanthroline2.090
    α,α′-Dipyridyl1.091
    Borate< /td>5094
    NaF2.092
    NaN32.092
    Triton X-1000.10%96
    Brij 350.10%
    Tween 200.10%95
    Span 200.10%94
    Na-cholate0.10%
    SDS0.05%95
    DAC 0.05%91
Ac, CH3CO;PCMB, p-Chloromercuribenzoate; MIA, Monoiodoacetate; NEM, N-Ethylmaleimide; IAA, Iodoacetamide;EDTA, Ethylenediaminete SDS, Sodium dodecyl sulfate; DAC, Dimethylbenzylalkylammonium chloride.

  • Fig.1. Stability (Powder form)

    (kept under dry conditions)

  • Fig.2. Stability (Powder form)

    Fig.2. Stability (Powder form)

    (kept under dry conditions)

  • Fig.3. Stability (Liquid form at 37℃)

    Fig.3. Stability (Liquid form at 37℃)

    enzyme concentration: 1.0mg/ml buffer composition: 0.1M K-phosphate buffer, pH7.5

  • Fig.4. pH-Activity

    Fig.4. pH-Activity

    (37℃, in 50mM K-phosphate buffer)

  • < p class="img imgAuto txtCenter">Fig.5. Temperature activity

    Fig.5. Temperature activity< /p>

    (in 50mM K-phosphate buffer,pH7.5)

  • Fig.6. pH-Stability

    Fig.6. pH-Stability

    30&# x2103;, 2hr-treatment with 50mM buffer solution:pH6.0-9.0, K-phosphate; pH9.0-10.0, glycine-NaCl-NaOH.

  • Fig.7. Thermal stability

    Fig.7. Thermal stability

    15min-treatment with 50mM K-phosphate buffer, pH7.5

활성 측정법(Japanese)

1. 원리

2. 정의

하기 조건 하에서 1분 동안 1 마이크로몰 H2O2를 생성하는 효소량을 1단위(U)로 한다.

3. 시약

  • 2.1% 염화콜린 용액(2.1g의 염화콜린을 0.1MTris-HCl 완충액, pH 8.0으로 용해시켜 100ml로한다) ;보존)
  • 1.0% 페놀 수용액(1.0g의 페놀을 증류수에 용해하여 100ml로 한다)(갈색병 중에서 4℃보존)
  • 0.1M Tris-HCl 완충액, pH 8.0〔12.1g의 트리스(MW=121.14)를 약 800ml의 증류수에 용해하고, 2.0NHCl로 pH8.0(25℃)으로 조제한 후 1000ml로 한다〕 /li>

효소 용액: 효소 표품을 미리 얼음 냉각한 0.1M Tris-HCl 완충액, pH 8.0에 용해시키고, 2.0mM EDTA와 1.0% KCl을 포함 10mM Tris-HCl 완충액, pH 8.0에서 0.1-0.5 U / ml로 희석한다.

4. 절차

1. 아래 반응 혼합물을 준비 한다(갈색병에서 빙냉 보존).

97.0ml기질 용액(A)< /td>
1.0ml4-AA 수용액액(B)
2.0ml페놀 수용액(C)
5.0ml peroxidase (110 풀 프로 갈린 단위 / mg)

2. 반응 혼합물 3.0ml를 큐벳 (d=1.0cm) 37 ~ 약 5 분간 예비 가온한다.

3. 효소 용액 0.05ml를 첨가하고, 천천히 혼화하고, 반응 혼액을 대조에 37℃로 제어된 분광광도 합계로 500nm의 흡광도 변화를 3~4분간 기록하고, 그 초기 직선 부분으로부터 분당 흡광도 변화를 구한다(ΔOD/min).

5. 수식

  • U/ ml =

  • ΔOD/min×3.05(ml)

    12.0×1/2×1.0×0.05(ml)

  • ×희석 배율

= ΔOD/min×10.17×희석 배율
U/mg=U/ml×1/C
12.0: Quinoneimine 염료의 상기 측정 조건 하 에서 밀리몰 분자 흡광 계수(cm2/micromole)
1/2: 산소 반응에서 생성된 H 2O2의 1분자의에서 형성하는 Quinoneimine 색소는 1/2분자인 것에 의한 계수.
1.0: 광로 길이(cm)
C : 용해시 효소 농도 (c mg/ml)

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