진단시약원료 효소

< img src="/inday_fileinfo/img/v520240422194449."

준비 및 사양

외관 황색 무정형 분말, 동결건조
활동 GradeⅢ 12U/mg-solid 이상
오염물질카탈라제≤1.0×10-1%
콜레스테롤 에스테라제≤1.0×10-2%
안정제 BSA, 아미노산

속성

< th align="left">최적 온도
안정성−20℃에서 안정적 최소 1년 동안 (그림 1)
분자량 대략. 55,000(겔 여과 기준)
미카엘리스 상수3.0×10-5M(콜레스테롤 )
억제제이온성 세제, Hg＋＋
최적 pH7.0−8.0(그림 2)
60℃(그림 3)
pH 안정성pH 5.0−10.0(25℃, 20시간)(그림 4)
열 안정성60℃ 미만 (pH 7.0, 15분)(그림 5)
기질 특이성(표 1)
다양한 화학물질의 영향(표 2)

애플리케이션

이 효소는 임상 분석에서 콜레스테롤에스테라제(COE-301, COE-311, COE-313)와 결합하여 혈청 내 콜레스테롤을 효소적으로 측정하는 데 유용합니다.

분석

원리

Principle

4-아미노안티피린 및 페놀과 결합하여 형성된 퀴노네이민 염료의 모양은 분광광도법으로 500nm에서 측정됩니다.

단위 정의

1 단위는 다음 조건 하에서 분당 1마이크로몰의 과산화수소(퀴논이민 염료의 0.5마이크로몰)를 형성합니다. 조건은 아래에 설명되어 있습니다.

방법

시약

A. 0.1M K-인산염 완충액, pH 7.0
B. 콜레스테롤 용액트리톤 X-100 5.0ml를 핫플레이트나 수조에 넣고 콜레스테롤 500mg을 넣고 콜레스테롤이 녹을 때까지 교반기로 섞는다. 뜨거운 콜레스테롤-Triton X-100 용액에 증류수 90ml를 교반 막대를 따라 천천히 부어 추가합니다. 약동하고 30~60초 동안 끓입니다. 용액이 흐려질 것입니다. 흐르는 물에 가볍게 저어주면서 식히면 용액이 투명해집니다. 콜산나트륨 4.0g을 넣고 녹인다. 증류수로 용액을 100ml까지 채웁니다. 이 용액은 실온에서 약 1주일 동안 안정하다. 흐려지면 맑아질 때까지 저어주면서 살짝 데워주세요.
C. 4-AA 용액1.76%(1.76g 4-아미노안티피린/100ml의 H2O)
라. 페놀 용액6.0%(6.0g 페놀/100ml의 H2O)
E. POD 용액양 고추냉이 과산화효소 15,000 퍼푸로갈린 단위/100ml 완충액(A)
F. 효소 희석제20mM K-인산염 완충액, pH 7.0 contg.0.2% 소 혈청 알부민
< /div>

절차

1.다음 작업을 준비하세요 용액(20회 분량)을 사용 직전에 갈색 병에 담아 얼음 위에 보관하세요.

51.0ml완충 용액(A)
4.0ml기질 용액 (B)
1.0ml4-AA 용액(C)
2.0mlPOD 솔루션(E)
< tr>
분석 혼합물의 농도
K-인산염 완충액87 mM
콜레스테롤0.89mM
4-아미노안티피린1.4mM
페놀21mM
Triton X-1000.34%
콜산나트륨< /th>64mM
BSA33μg/ml
POD5U/ml

2.2.9ml의 작업 용액을 큐벳(d=1.0cm)에 피펫으로 넣고 평형을 유지합니다. 37℃에서 약 3분간. 페놀용액(D) 0.1ml를 넣고 섞은 후 37°C에서 보관합니다. 2분간 더 기다리세요.

3.효소 용액 0.1ml*를 넣고 가볍게 뒤집어 섞으세요.< /p>

4.37℃로 온도가 조절된 분광 광도계에서 물에 대해 3~4분간 500nm에서 광학 밀도의 증가를 기록하고 ℃를 계산합니다. #x394;곡선의 초기 부분부터 분당 OD(OD 테스트). 동시에 효소용액 대신 효소희석액을 첨가하는 것을 제외하고는 시험과 동일한 방법으로 공시험률(ΔOD 공백)을 측정한다.

*효소 제제를 얼음처럼 차가운 효소희석액(F)에 녹이고, 동일한 완충액으로 0.1−0.3 U/ml로 희석하여 얼음에 보관합니다. p>

계산

활동은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다:

< ul class="fractionBox">

  • 볼륨 활동(U/ml) =

  • ΔOD/min (ΔOD 테스트−ΔOD 공백)×Vt×df

    13.78×1/ 2×1.0×Vs

    • = ΔOD/min×4.499×df

    체중활동량(U/mg) = (U/ml)×1/C

    Vt: 전체 용량(3.1ml)
    Vs: 샘플 용량(0.1ml)
    13.78: 분석 조건에서 퀴노네이민 염료의 밀리몰 흡광 계수(cm2/마이크로몰)
    1/2 : 1몰의 H2O2가 0.5몰의 퀴논이민 염료를 생성한다는 사실에 근거한 인수입니다.
    1.0: 광선 길이(cm)
    df: 희석 계수
    C: 용해 시 효소 농도(c mg/ml)

    참조

    1)W.Richmond; Clin.Chem., 19, 1350(1973).

    2)HMFlegg; Ann.Clin.Biochem., 10, 79(1973).

    3)CC Alain et al; Clin.Chem., 20, 470(1974).

    4)PNTarbutton 및 CRGunter; Clin.Chem., 20, 724(1974).

    5)S.Nomoto; Rinsho Kensa, 20, 688(1976).

    6)K.Kameno 외; Jap.J.Clin.Path., 24, 650(1976).

    7)Y.Nishiya 외; Protein Engng,7, 231 (1997).

    표 1. 콜레스테롤 산화효소의 기질 특이성

    • < td>β-시토스테롤
      • 기판(0.1mM)상대 활성도(%)
      콜레스테롤100.0
      프레그네놀론60.0
      β-콜레스타놀60.0
      120.0
      스티그마스테롤34.0
      < tr>
      기질(0.1mM)상대활성도(%)
      에르고스테롤44.0
      라노스테롤1.6
      테스토스테론1.0
      안드로스테론1.5
      디하이드로이소안드로스테론 15.0

    표 2. 다양한 효과 콜레스테롤 산화효소에 대한 화학물질

    ［효소는 10mM K-인산염 완충액(pH 7.0 contg)에 용해되었습니다. 0.2% BSA (1.0U/ml) was incubated with each chemical at 25℃ for 1hr.]

    • < td>0
      ChemicalConcn.(mM)Residual activity(%)
      None- 100
      Metal salt2.0
      MgCl 2100
      CaCl2 100
      Ba(OAc)2100
      FeCl3100
      CoCl2100
      MnCl2100
      Zn(OAc)2< /td>100
      Cd(OAc)2100
      NiCl2100
      CuSO290
      Pb(OAc)2 100
      HgCl2
      PCMB2.0100
      MIA< /td>2.0100
    • < td>NaF< tr>< tr>< td>100
      ChemicalConcn.(mM)Residual activity(%)
      20100
      NaN320 100
      EDTA-2Na5.0100
      o-Phenanthroline2.0100
      α,α′-Dipyridyl1.0100
      Borate50100
      IAA2.0100
      NEM2.0
      Hydroxylamine2.0100
      2- Mercaptoethanol2.0100
      Triton X-1000.10%100
      Tween 200.10%94
      Span 200.10%90
      Na-cholate0.10%100
      SDS0.05%100
      DAC< /td>0.05%100
      • < /ul>
      Ac, CH3CO; PCMB, p-Chloromercuribenzoate; MIA, Monoiodoacetate; NEM, N-Ethylmaleimide; IAA, lodoacetamide;
      EDTA, Ethylenediaminetetraacetate; SDS, Sodium dodecyl sulfate; DAC, Dimethylbenzylalkylammonium chloride.
      alt="Fig.1. Stability (Powder form)">

      Fig.1. Stability (Powder form)

      (kept under dry conditions)

    • Fig.2. pH-Activity

      Fig.2. pH-Activity

      (37℃ in 0.1M K-phosphate buffer solution)

      < /li>

    • Fig.3. Temperature activity

      Fig.3. Temperature activity

      (in 0.1M K-phosphate buffer,pH 7.0)

    • Fig.4. pH-Stability

      Fig.4. pH-Stability

      25℃ 20 hr-treatment with 50mM buffer solution
      pH5.0-6.0, acetate buffer
      pH6.5-8.5, K-phosphate buffer
      pH9.0-10.0, Gly-NaOH buffer

    • Fig.5. Thermal stability

      Fig.5. Thermal stability

      15 min-treatment with 50mM K-phosphate buffer, pH7.0

    활성 측정법(Japanese)

    < p class="ttl_16">1. 원리

    원리

    4-Aminoantipyrine과 페놀의 산화 축합 생성물인 Quinoneimine 염료를 500nm에서 측정하고, 상기 반응에서 생성된 H2O2량을 정량 한다.

    2. 정의

    하기 조건 하에서 1분 동안 1 마이크로몰 H2O2를 생성하는 효소량을 1단위(U)로 한다.

    3. 시약

    • 0.1M K-인산 완충액, pH 7.0
    • 콜레스테롤 용액 [5.0ml의 Triton X-100에 500mg의 콜레스테롤을 첨가하고 히터상에서 교반 용해한다. 여기에 90ml의 증류수를 부드럽게 첨가하고, 교반 혼합 후, 히터상에서 30~60초 끓인다(용액은 탁한다). 이어서 완만하게 교반하면서 유수 중에서 냉각하고(용액은 청징화한다), 이것에 4.0g의 콜산나트륨염(나카라이테스크제)을 첨가하여 교반 용해시킨 후, 증류수로 최종 액량을 100ml로한다] (용액은 실온에서 적어도 1 주간은 보존 가능, 만약 보존 중에 탁하는 경우는 교반하면서 가온 청징화하면 된다)
    • 4-AA 수용액:1.76% ( 4-아미노안티피린 1.76g을 물에 용해하여 100ml로 한다)
    • 페놀 수용액:6.0% (페놀 6.0g을 물에 용해하여 100ml로 한다)
    • POD 용액 : Peroxidase 150mg (100 풀 프로 갈린 단위 / mg)을 100ml의 완충액 (A)에 용해시킨다.

    효소 용액: 효소 표제를 미리 빙냉한 0.2%의 BSA를 함유하는 20mM K-인산 완충액, pH 7.0에서 용해하고, 동완충 용액으로 0.1-0.3 U/ml로 희석한다.

    4. 절차

    1. 아래 반응 혼합물을 준비 한다.

    51.0mlK-포스페이트 완충액 (A)
    4.0ml기질 용액(B)
    1.0ml4-AA 수용액(C)
    2.0ml< /td>POD 용액(E)
    (갈색 병에서 얼음 냉각 저장)

    2. 반응 혼합물 2.9ml를 큐벳(d=1.0cm)에 넣고 37 ℃에서 약 3 분간 예비 가온하고, 0.1 ml의 페놀 수용액을 첨가하여 추가로 2 분간 가온한다.

    3. 효소 용액 0.1ml를 가하고 부드럽게 혼합하고 물을 대조군으로 37℃로 제어한 분광광도계로 500nm의 흡광도의 증가를 3~4분간 기록하고, 그 직선 부분으로부터 분당 흡광도 변화를 구한다(ΔOD test).

    3. 맹검은 반응 혼합물에, 효소 용액 대신에 효소 희석액 (0.2% BSA를 포함하는 20 mM K-인산 완충액 , pH 7.0)을 0.1ml 첨가하고, 상기와 같이 조작을 행하여 1분간 당의 흡광도 변화를 구한다(ΔODblank).

    5. 수식

    • U/ ml =

    • ΔOD/min (ΔOD test−ΔOD blank)×3.1 (ml)×희석 배율

      13.78×1/2×1.0×0.1(ml)

    = ΔOD/min×4.499×희석 배율
    U/mg ==U/ml×1/C
    13.78: Quinoneimine 염료의 상기 측정 조건 하에서의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm 2/micromole)
    1/2: 산소 반응에서 생성된 H2O2의 2 분자로 형성되는 Quinoneimine 색소는 1분자인 것에 의한 계수.
    1.0: 광로 길이(cm)
    C : 용해시 효소 농도 (c mg/ml)

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