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준비 및 사양
속성
| 안정성 | −20℃에서 안정적 최소 1년 동안 (Fig.1) |
|---|---|
| Michaelis 상수 th> | 5.7×10-5M(리놀리에이트),7.2×10-5M(올리에이트) |
| Hg++, Cu++ | |
| 최적 pH | 6.0(그림 2) |
| 최적 온도 | 40℃(그림 3) |
| pH 안정성 | pH 5.5−10.0(25℃, 20시간)(그림. 4) |
| 열 안정성 | 40℃ 미만 (pH 7.0, 15분)(그림 5) |
| 다양한 효과 화학물질 | (표 1) |
응용 프로그램
이 효소는 콜레스테롤 산화효소(COO-311, COO-321, COO)와 결합하여 총 콜레스테롤을 효소적으로 측정하는 데 유용합니다. -331) 임상 분석에서.
분석
원칙
4-아미노안티피린과 페놀이 결합하여 형성된 퀴노네이민 염료의 외관은 분광광도법으로 500nm에서 측정됩니다.
단위 정의
1 단위는 다음 조건 하에서 분당 1마이크로몰의 과산화수소(퀴논이민 염료의 0.5마이크로몰)를 형성합니다. 조건은 아래에 설명되어 있습니다.
방법
시약
| A. 0.2M K-인산염 완충액, pH 7.0 | |
|---|---|
| B. 콜레스테롤리놀레이트용액 | 콜레스테롤리놀레이트 39mg에 이소프로판올 2.0ml를 가하고 약간 가열하면서 완전히 녹인다. 콜레스테롤 리놀리에이트 용액에 1.0%(v/v) 뜨거운 Triton X-100 용액(72−74℃ 예열) 약 80ml를 혼합하고 용액을 온수 욕조(72−74℃)에 보관합니다. , 30분 동안 교반하면서. 용액이 맑아졌다가 흐려집니다. 용액의 온도가 실온으로 내려갈 때까지 부드럽게 교반하면서 흐르는 물에서 식힙니다. 나콜레이트 600mg을 첨가하고 녹인다. 1.0% Triton X-100 용액으로 용액을 100ml까지 채웁니다. 이 솔루션은 4℃에서 안정적입니다. 최소 5일 동안. |
| C. 4-AA 용액 | 1.76%(4-아미노안티피린 1.76g/H2O 100ml)(갈색병에 4℃ 보관) | < /tr>
| 라. 페놀 용액 | 6.0%(페놀 6.0g/H2O 100ml)(갈색 병에 담아 4°C에 보관) | 마. POD 용액 | 고추냉이과산화효소(Toyobo, GradeIII) 7,500 푸르푸로갈린 단위/50ml 0.1M K-인산염 완충액, pH 7.0(150 PU/ml)(새로 준비) | < tr>F. COD 솔루션 | Streptomyces sp. 콜레스테롤산화효소(도요보, 3급) 1,500U/5.0ml 얼음물 H2O(300U/ml)(신선하게 준비) |
| 지. 효소 희석제 | 20mM K-인산염 완충액, 2mM MgCl2, 0.5mM EDTA-Na3 및 0.2% BSA를 함유하는 pH 7.5 |
절차
1.갈색 병에 다음 작업 용액(50개 테스트)을 준비합니다.
| 75ml | 완충 용액 | (A) |
|---|---|---|
| 50ml | < td>기질 용액(B) | |
| 2.5ml | 4-AA 용액 | (C ) |
| 5.0ml | 페놀 용액 | (D) | 5.0ml | POD 솔루션 | (E) |
| (이 용액은 4℃에서 최소 5일 동안 안정합니다.) | ||
| 분석 혼합물의 농도 | |
|---|---|
| K -인산염 완충액 | 0.11M |
| 콜레스테롤 리놀리에이트 | 0.20mM |
| 4-아미노안티피린 | 1.5mM |
| 페놀 | 22mM |
| EDTA | 17μM |
| 이소프로판올 | 0.68% | < /tr>
| COD | 약 10U/ml |
| POD | ca. 5.1U/ml |
2. 작업 용액 2.75ml를 큐벳(d=1.0cm)에 피펫팅하여 37°C에서 평형화합니다. 약 5분 동안. COD 용액(F) 0.1ml를 넣고 섞어서 37°C에서 보관합니다. 2분간 더 기다리세요.
3.효소 용액* 0.1ml를 첨가하고 가볍게 뒤집어 섞으세요.
4.37°로 온도가 조절된 분광 광도계에서 물에 대해 3~4분 동안 500nm에서 광학 밀도의 증가를 기록하고 분당 OD를 계산합니다. 곡선의 초기 선형부분(ΔODtest)과 동시에 효소희석제(G)를 첨가하는 것을 제외하고는 test와 동일한 방법으로 바탕율(ΔODblank)을 측정한다. 효소 용액 대신 첨가됩니다.
*효소 제제를 얼음처럼 차가운 효소 희석제(G)에 녹이고, 분석 직전에 동일한 완충액으로 0.08−0.22U/ml로 희석합니다.
계산
활동량은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다:
활동량(U/ml) =
ΔOD/min (ΔOD 테스트−ΔOD 공백)×Vt× df
13.78×1/2×1.0×Vs
= Δ ;OD/min×4.282×df
체중 활동도(U/mg) = (U/ml)×1/C
| Vt | : 총 용량(2.95ml) |
| Vs | : 시료량(0.1ml) |
| 13.78 | : 분석 조건에서 퀴논이민 염료의 밀리몰 흡광계수(cm2 /micromole) |
| 1/2 | : H2O 1몰이 2는 0.5몰의 퀴논이민 염료를 생성합니다. |
| 1.0 | : 빛의 경로 길이(cm) |
| df | : 희석 인자 |
| C | : 용해 시 효소 농도(c mg/ml) |
참조
1)CCAllain, LSPoon, CSGChan, W.Richmond 및 PCFu; Clin.Chem., 20, 470(1974).
2)Y.Kameno, N.Nakano 및 S.Baba; Jap.J.Clin.Path., 24, 650(1976).
표 1. Effect of Various Chemicals on Cholesterol esterase
[The enzyme (40U/ml) was incubated at 25℃ for 1hr with each chemical.]
Chemical Concn.(mM) Residual activity(%) None - 100 CaCl2 2.0 103 Ba(OAc)2 2.0 93 FeCl3 2.0 97 CoCl2 2.0 98 MnCl2 2.0 82 Zn(OAc)2 2.0 100 NiCl2 2.0 < td>99Pb(OAc)2 2.0 76 < /tr>AgNO3 2.0 94 HgCl< sub>2 2.0 58 CdCl2 1.0 101 CuSO4 1.0 1.5 NEM 2.0 101 PCMB 2.0 91 - < div class="tableWrap">
Chemical Concn.(mM) Residual activity(%) MIA 2.0 95 NaF 20.0 101 NaN3 20.0 100 EDTA 5.0 88 o-Phenanthroline 2.0 100 α,α′-Dipyridyl 2.0 96 Borate 20.0 99 Triton X-100 1.0% < td>84Brij 35 1.0% 99 SDS 0.1% 91 Tween 20 0.1% 98 Span 20 0.1% 101 Na- cholate 1.0% 99 Taurocholate 0.1% 100
Fig.1. Stability (Powder form)
(kept under dry conditions)
Fig.2. pH-Activity
37℃ in 0.1M buffer solution: pH3.5-5.5,acetate; pH5.5-8.0,K-phosphate; pH8.0-9.0,Tris-HCl
< /li>Fig.3. Temperature activity
(in 0.1M K-phosphate buffer, pH7.0)
Fig.4. pH-Stability
25℃,20hr-treatment with 0.1M buffer solution: pH4.0-6.5,acatate: pH6.0-8.0,K-phosphate: pH8.0-10.0Tris-HCl
Fig.5. Thermal stability
15min-treatment with 0.1M K-phosphate, pH7.5 enzyme concn. 20 U/ml
활성 측정법(Japanese)
1. 원리
4-AA 및 페놀의 산화 축합 생성물 인 Quinoneimine 염료를 500nm에서 측정하고, 상기 반응에서 생성 된 H 2 O 2 의 양 (가수 분해 된 Cholesterol ester의 양 )를 정량한다.
2. 정의
하기 조건 하에서 1분에 1 마이크로몰의 cholesterol ester를 가수분해하는 효소량을 1단위 ( U)로 한다.
3. 시약
- 0.2M K-인산 완충액, pH7.0
- 콜레스테롤 리놀레이트 용액 [39mg의 콜레스테롤 리놀레이트를 정밀하고 2.0ml의 이소프로판올을 첨가하고 완전히 가온 용해시킨다. 그것을 미리 72~74℃에 가온해 둔 약 80ml의 1.0%(V/V) 트리톤 X-100 용액과 혼화하고, 또한 72~74℃의 온탕 중에서 교반하면서 30 분간 유지 한 후, 유수에서 실온으로 냉각시킨다. 이어서 600mg의 콜산 나트륨을 첨가하여 용해시키고, 상기 1.0% 트리톤 X-100 용액으로 최종 액량을 100ml로 한다](4℃ 보존으로 5일간은 사용 가능)
- 1.76 % 4-AA 수용액 [1.76g의 4- 아미노 안티 피린을 100ml의 증류수에 용해시키고 갈색 병에 4 & # x2103;에 저장한다]
- 6.0 % 페놀 수용액 [6.0g의 페놀 100ml의 증류수에 용해시키고 갈색 병에 4 & # 2103;에 저장한다
- POD 용액 - 인산 완충액, pH 7.0에 용해한다(150PU/ml)](용시 조제) ml의 얼음 냉 증류수에 용해한다(300 U/ml)](용시 조제) .5 mM ETDA-Na3 및 0.2 % BSA를 함유하는 20 mM K- 인산염 완충액, pH 7.5에서 용해시키고 분석 직전에 동일한 완충액으로 0.08-0.22 U / ml로 희석한다.
4. 절차
1. 50 테스트)를 갈색 병에서 준비합니다 (4 & # x2103; 보관에서 5 일 동안 사용 가능).
75ml K-인산염 완충액 < td class="w20p">(A)50ml 기질 용액 (B) 2.5ml 4-AA 수용액 (C) 5.0ml 페놀 수용액 (D) 5.0ml POD 용액 (E ) 2. 반응 혼합물 2.75ml를 시험관에 넣고 37℃ 약 5 분간 예비 가온하고, 0.1 ml의 COD 용액을 첨가하여 추가로 2 분간 가온한다.
3. 효소 용액 0.1ml를 첨가하고 완만하게 혼합한 후, 물을 대조군으로 37℃로 제어된 분광광도계 에서 500nm의 흡광도 변화를 3~4분간 기록하고, 그 초기 직선 부분으로부터 분당 흡광도 변화를 구한다(ΔOD test).
4.맹검은 COD 첨가액 2에 효소 용액 대신에 효소 희석액(2mM MgCl2, 0.5mM EDTA-Na3 및 0.2% BSA)를 포함하는 20mMK-인산 완충액, pH 7.5를 0.1ml 첨가하고, 상기와 같이 조작을 행하여 1분간당의 흡광도 변화를 구한다 (ΔODblank).
5. 수식
U/ ml =
ΔOD/min (ΔOD test−ΔOD blank)×2.95 (ml)×희석 배율
13.78×1/2×1.0×0.1(ml)
= ΔOD/min×4.282×희석 배율 U/mg =U/ml×1/C 13.78 : Quinoneimine 염료의 상기 측정 조건 하에서의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm< sup>2/micromole) 1/2 : H2O2< /sub>의 1분자로부터 형성하는 Quinoneimine 염료는 1/2분자인 것에 의한 계수 C : 용해시 효소 농도(c mg/ml)
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