진단시약원료 효소

< img src="/inday_fileinfo/img/v520240422194449.">

준비 및 사양

< table class="darkGray"> 성상 연한 갈색 무정형 분말, 동결건조< /tr> 활동 GradeⅢ 100U/mg-solid 이상
(약 40% 함유) 안정제) 오염물질카탈라아제≤1.0×10- 2% 안정 장치 Mg＋+, Na-cholate, BSA

속성

안정성< /th>−20℃에서 안정적입니다. 최소 1년 동안 (그림 1)
분자량약. 300,000
등전점5.9±0.1
미카엘리스 상수5.4×10-5M(리놀리에이트),6.6×10-5 M(올리에이트),
3.7×10-5M(리놀렌산염),1.5×10-4M(팔미테이트)
1.2×10-4M(미리스테이트),2.3×10-5M (스테아레이트)
억제제Hg＋＋, Ag＋ , 이온 세제
최적 pH7.0−9.0(그림 4)
최적 온도40℃(그림 5)
pH 안정성pH 5.0− 9.0(25℃, 24시간)(그림 6)
열 안정성55℃ 이하 (pH 7.5, 10분)(그림 7)
기질 특이성< /th>(표 1)
다양한 화학물질의 영향(표 2)< /td>

애플리케이션

이 효소는 임상 분석에서 콜레스테롤 산화효소(COO-311, COO-321, COO-331)와 결합하여 총 콜레스테롤을 효소적으로 측정하는 데 유용합니다.

분석

원칙

Principle

4-아미노안티피린 및 페놀과 결합하여 형성된 퀴노네이민 염료의 모양은 분광광도법으로 500nm에서 측정됩니다.

단위 정의

1 단위는 다음 조건 하에서 분당 1마이크로몰의 과산화수소(퀴논이민 염료의 0.5마이크로몰)를 형성합니다. 조건은 아래에 설명되어 있습니다.

방법

시약

< /tr>< tr>< tr>< align="left" class="w33p">G. 효소 희석제
A. 0.2M K-인산염 완충액, pH 7.0
B. 콜레스테롤리놀레이트시액콜레스테롤리놀레이트 39mg에 이소프로판올 2.0ml를 가하고 약간 가열하여 완전히 녹인다. 콜레스테롤 리놀리에이트 용액에 1.0%(v/v) 뜨거운 Triton X-100 용액(72−74℃예열) 약 80ml를 섞어 온수욕(72−74℃)에 보관합니다. , 30분 동안 교반하였다. 용액이 맑아졌다가 흐려집니다. 용액의 온도가 실온으로 내려갈 때까지 부드럽게 교반하면서 흐르는 물에서 식힙니다. Na-cholate 600mg을 첨가하고 녹인다. 1.0% Triton X-100 용액으로 용액을 100ml까지 채웁니다. 이 솔루션은 4℃에서 안정적입니다. 최소 5일 동안.
C. 4-AA 용액1.76%(4-아미노안티피린 1.76g/H2O 100ml)(갈색병에 4℃ 보관)
라. 페놀 용액6.0%(페놀 6.0g/H2O 100ml)(갈색 병에 담아 4°C에 보관)
마. POD 용액 고추냉이과산화효소(Toyobo, GradeIII) 7,500 푸르푸로갈린 단위/50ml 0.1M K-인산염 완충액, pH 7.0(150 PU/ml)(새로 준비)
F. COD 솔루션 Streptomyces sp. 콜레스테롤산화효소(Toyobo, GradeIII) 1,500U/5.0ml 얼음물 H2O(300U/ml)(신선하게 준비해야 함)
20mM K-인산염 완충액, 2mM MgCl2, 0.5mM EDTA-Na3 및 0.2% BSA를 함유하는 pH 7.5

절차

1.갈색 병에 다음 작업 용액(50개 테스트)을 준비합니다.

< td>기질 용액< tr>
75ml완충 용액(A)
50ml(B)
2.5ml4-AA 용액(C )
5.0ml페놀 용액(D)
5.0mlPOD 솔루션(E)
(이 용액은 4℃에서 최소 5일 동안 안정합니다.)
< /tr>
분석 혼합물의 농도
K -인산염 완충액0.11M
콜레스테롤 리놀리에이트0.20mM
4-아미노안티피린1.5mM
페놀22mM
EDTA17μM
이소프로판올0.68%
COD약 10U/ml
PODca. 5.1U/ml

2. 작업 용액 2.75ml를 큐벳(d=1.0cm)에 피펫팅하여 37°C에서 평형화합니다. 약 5분 동안. COD 용액(F) 0.1ml를 넣고 섞어서 37°C에서 보관합니다. 2분간 더 기다리세요.

3.효소 용액* 0.1ml를 첨가하고 가볍게 뒤집어 섞으세요.

4.37°로 온도가 조절된 분광 광도계에서 물에 대해 3~4분 동안 500nm에서 광학 밀도의 증가를 기록하고 분당 OD를 계산합니다. 곡선의 초기 선형 부분(ΔODtest).
동시에 효소희석제(G)를 첨가하는 것을 제외하고는 시험과 동일한 방법을 이용하여 바탕율(ΔODblank)을 측정한다. 효소 용액 대신 첨가됩니다.

*효소 제제를 얼음처럼 차가운 효소 희석제(G)에 녹이고, 분석 직전에 동일한 완충액으로 0.08−0.22U/ml로 희석합니다.

계산

활동량은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다:

  • 활동량(U/ml) =

  • ΔOD/min (ΔOD 테스트−ΔOD 공백)×Vt× df

    13.78×1/2×1.0×Vs

= Δ ;OD/min×4.282×df

체중 활동도(U/mg) = (U/ml)×1/C

< tbody>
Vt: 총 용량(2.95ml)
Vs : 시료량(0.1ml)
13.78: 분석 조건에서 퀴논이민 염료의 밀리몰 흡광계수(cm2 /micromole)
1/2: H2O 1몰이 2는 0.5몰의 퀴논이민 염료를 생성합니다.
1.0: 빛의 경로 길이(cm)
df: 희석 인자
C: 용해 시 효소 농도(c mg/ml)

참조

1)CCAllain, LSPoon, CSGChan, W.Richmond 및 PCFu; Clin.Chem., 20, 470(1974).

2)Y.Kameno, N.Nakano 및 S.Baba; Jap.J.Clin.Path., 24, 650 (1976).

표 1. 콜레스테롤 에스테라제의 기질 특이성

[반응은 37℃ 0.1M K-인산염 완충액, pH 7.0 contg. 0.2mM cholesterol ester, 0.33% Triton X-100 and 0.2% Na-cholate.]

  • Cholesterol esterRelative activity(%)
    Linoleate(18:2)100
    Acetate(2:0)2.9
    Propionate(3:0)21.3
    Crotonate(4:1)0.0
    Valerate(5:0)8.0
    Caproate(6:0)17.3
    Heptanoate(7:0)18.6
    Caprylate(8:0)58.6
    Nonanoate(9:0)48.0
    Decylate(10:0)40.0
    10-Undecenoate(11:1)114.6
    Laurate(12:0)54.6
  • Cholesterol esterRelative activity(%)
    Tridecanoate< span class="floatRight">(13:0)53.3
    Myristate(14: 0)49.3
    Pentadecanote(15:0) 46.6
    Palmitate(16:0)33.5
    Heptadecanoate(17:0)0.0
    Stearate< span class="floatRight">(18:0)8.0
    Oleate(18: 1)105.3
    Lelaidate(18:3) 166.5
    Phenyl acetate0.0
    Cinnamate 0.0
    Benzoate58.6
    < /div>
Number of carbon atoms and double bonds are given in parenthesis.

Table 2. Effect of Various Chemicals on Cholesterol esterase

[The enzyme (13.5U/ml) was incubated at 25℃ for 1hr with each chemical.]

  • < tr>< tr>
    ChemicalConcn.(mM)Residual activity(%)
    None-100
    Metal salt2.0
    CaCl296
    Ba(OAc)2100
    FeCl 387
    CoCl2 97
    MnCl288
    Zn(OAc)283
    NiCl299
    Pb(OAc)295
    AgNO3 51
    HgCl214
    NEM2.0100
    PCMB2.0 100
  • ChemicalConcn.(mM)Residual activity(%)
    MIA2.0 96
    NaF20.099
    NaN320.0100
    EDTA 5.0100
    o-Phenanthroline2.0100
    α,α′-Dipyridyl2.099
    Borate 20.0100
    Triton X-1001.0%97
    Brij 351.0%100
    SDS0.1 %8
    Na-cholate1.0%100
    Taurocholate0.1%100
Ac, CH3CO; NEM, N-Ethylmaleimide; PCMB, p-Chloromercuribenzoate; MIA, Monoiodoacetate;
EDTA, Ethylenediaminetetraacetate; SDS, Sodium dodecyl sulfate.

  • Fig.1. Stability (Powder form)

    (kept under dry conditions)

  • Fig.2. Stability (Powder form)

    Fig.2. Stability (Powder form)

    (kept under dry conditions)

    • < li>

    Fig.3. Stability (Liquid form at 5℃)

    Fig.3. Stability (Liquid form at 5℃)

    enzyme concentration:673.5U/ml buffer composition :0.1M K-phosphate buffer,pH7.0

  • Fig.4. pH-Activity

    Fig.4. pH-Activity

    (37℃,in 0.2 M K-phosphate buffer)

  • Fig.5. Temperature activity

    Fig.5. Temperature activity

    (in 0.1M K-phosphate buffer,pH7.0)

  • Fig.6. pH-Stability

    Fig.6. pH-Stability

    25℃, 24hr-treatment with 0.2M Britton-Robinson buffer

  • Fig.7. Thermal stability

    Fig.7. Thermal stability

    10min-treatment with 20mM K-phosphate buffer,pH7. 5 contg. 2mM MgCl2& 0.5mM EDTA · Na3

활성 측정법(Japanese)

1. 원리

원리

4-AA와 페놀의 산화 축합 생성물인 Quinoneimine 염료를 500nm 에서 측정하고, 상기 반응에서 생성된 H2O2의 양(가수분해된 Cholesterol ester의 양)을 정량한다.

2. 정의

하기 조건 하에서 1분에 1 마이크로몰의 cholesterol ester를 가수분해하는 효소량을 1단위 ( U)로 한다.

3. 시약

  • 0.2M K-인산 완충액, pH7.0
  • 콜레스테롤 리놀레이트 용액 [39mg의 콜레스테롤 리놀레이트를 정밀하고 2.0ml의 이소프로판올을 첨가하고 완전히 가온 용해시킨다. 그것을 미리 72~74℃에 가온해 둔 약 80ml의 1.0%(V/V) 트리톤 X-100 용액과 혼화하고, 또한 72~74℃의 온탕 중에서 교반하면서 30 분간 유지 한 후, 유수에서 실온으로 냉각시킨다. 이어서 600mg의 콜산 나트륨을 첨가하여 용해시키고, 상기 1.0% 트리톤 X-100 용액으로 최종 액량을 100ml로 한다](4℃ 보존으로 5일간은 사용 가능)
  • 1.76 % 4-AA 수용액 [1.76g의 4- 아미노 안티 피린을 100ml의 증류수에 용해시키고 갈색 병에 4 & # x2103;에 저장한다]
  • 6.0 % 페놀 수용액 [6.0g의 페놀 100ml의 증류수에 용해시키고 갈색 병에 4 & # 2103;에 저장한다
  • POD 용액 - 인산 완충액, pH 7.0에 용해한다(150PU/ml)](용시 조제) ml의 얼음 냉 증류수에 용해한다(300 U/ml)](용시 조제) .5 mM ETDA-Na3 및 0.2 % BSA를 함유하는 20 mM K- 인산염 완충액, pH 7.5에서 용해시키고 분석 직전에 동일한 완충액으로 0.08-0.22 U / ml로 희석한다.

    4. 절차

    1. 50 테스트)를 갈색 병에서 준비합니다 (4 & # x2103; 보관에서 5 일 동안 사용 가능).

    < td class="w20p">(A)
    75mlK-인산염 완충액
    50ml기질 용액(B)
    2.5ml4-AA 수용액(C)
    5.0ml페놀 수용액(D)
    5.0mlPOD 용액(E )

    2. 반응 혼합물 2.75ml를 시험관에 넣고 37℃ 약 5 분간 예비 가온하고, 0.1 ml의 COD 용액을 첨가하여 추가로 2 분간 가온한다.

    3. 효소 용액 0.1ml를 첨가하고 완만하게 혼합한 후, 물을 대조군으로 37℃로 제어된 분광광도계 에서 500nm의 흡광도 변화를 3~4분간 기록하고, 그 초기 직선 부분으로부터 분당 흡광도 변화를 구한다(ΔOD test).

    4.맹검은 COD 첨가액 2에 효소 용액 대신에 효소 희석액(2mM MgCl2, 0.5mM EDTA-Na3 및 0.2% BSA)를 포함하는 20mMK-인산 완충액, pH 7.5를 0.1ml 첨가하고, 상기와 같이 조작을 행하여 1분간당의 흡광도 변화를 구한다 (ΔODblank).

    5. 수식

    • U/ml =

    • ΔOD/min (ΔOD test−ΔOD blank)×2.95(ml)×희석 배율

      13.78×1/2×1.0×0.1(ml)

    = ΔOD/ min×4.282×희석 배율
    U/mg=U/ml×1/C
    13.78: Quinoneimine 염료의 상기 측정 조건 하에서 밀리몰 분자 흡광 계수(cm2/micromole)
    1/2: H2O2의 1분자로 형성되는 Quinoneimine 염료는 1/2분자로 어떤 것에 의한 계수 >: 용해시 효소 농도(c mg/ml)

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