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준비 및 사양
(안정제 약 20% 함유)
속성
| 안정성 | −20℃에서 안정적 최소 1년 동안(그림 1,2) |
|---|---|
| 분자량 | < td>대략. 130,000|
| 등전점 | 4.1±0.1 |
| 미카엘리스 상수 | 3.9×10-5M(리놀리에이트),9.2×10-5M(팔미테이트),< /td> |
| 6.3×10-5M(데실레이트),8.8×10-5M(프로피오네이트) | |
| 억제제 | 중금속 이온(Hg++, Ag+, Fe＋＋＋) |
| 최적 pH | 4.8−8.0(콜레스테롤 리놀리에이트), 5.0 ( 혈청)(그림 5) |
| 최적 온도 | 55−60& #x2103;(그림 6) |
| pH 안정성 | pH 2.5 −7.5(25℃, 20시간)(그림 7) |
| 열 안정성 | 55℃ 미만 (pH 5.5, 10분)(그림 8) |
| 기질 특이성 | (표 1) |
응용 프로그램
이 효소는 임상 분석에서 콜레스테롤 산화효소(COO-311, COO-321, COO-331)와 결합하여 콜레스테롤을 효소적으로 측정하는 데 유용합니다.< /p>
분석
원칙
인다민의 출현은 분광 광도법으로 590nm에서 측정됩니다.
단위 정의
아래 설명된 조건에서 하나의 단위는 분당 1마이크로몰의 콜레스테롤 에스테르를 가수분해합니다.
방법
시약
| A. COD-POD 용액 | 14.4g Na2HPO4・12H2O, 31g 붕산, 15,000 U COD (GradeⅢ), 25,000 PUPOD, 콜산나트륨 290mg/H2O 1,000ml (pH 6.5로 조정) (0-5℃에서 보관시 한달간 안정함) |
|---|---|
| B. DMA-MBTH 용액 | 400mg EDTA-Na2, 0.7ml DMA, 150mg MBTH/1,000ml의 0.5M 아세테이트 완충액, pH4.7(온도에서 보관하면 일주일 동안 안정적) 0−5℃ 갈색 병에 들어 있음) |
| C. 콜레스테롤리놀레이트용액 | 0.6mM［콜레스테롤리놀리에이트 40mg을 무수에탄올 8.0ml에 핫플레이트 위에 녹이고 1.0%(V/V) Triton X-100용액 90ml를 섞어 70°C에서 보관 x2103; 중탕에 15분간 담근 후 흐르는 물에 상온으로 식힌 후 1.0%(V/V) Triton X-100을 100ml까지 채운다(신선하게 준비해야 함)] |
| 디. HCl 용액 | 1.0N |
| E. 효소 희석제 | 10mM 인산염 완충액, pH 7.0. |
절차
1.다음 반응 혼합물을 시험관에 준비하고 37℃에서 약 5분간.
| 1.0ml | COD-POD 솔루션 | (A) |
|---|---|---|
| 1.0ml | DMA-MBTH 솔루션 | (B) | < /tr>
| 0.1ml | 효소액* |
2.기질용액(C) 1.0ml를 넣고 혼합합니다.
3.정확히 10분 후 37℃에 HCl용액(D) 1.0ml를 첨가하여 반응을 정지시킨 후 물에 대하여 590 nm에서 광학밀도를 측정한다(OD test).
동시에 반응혼합물을 먼저 혼합하여 바탕액을 준비한다. (효소용액 대신 기질용액 1.0ml 사용) 37°C에서 10분간 배양한 후 HCl용액(D) 1.0ml를 첨가하고, 효소용액(OD 공백)의 효소를 첨가한다.
*효소제를 얼음처럼 차가운 효소희석액에 녹여 0.02〜0.05U/ml로 희석합니다. buffer.
계산
활동은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다.< /p>
볼륨 활동(U/ml) =
ΔOD(OD 테스트−OD 공백)×Vt×df
39.0×t×Vs
< /li>= ΔOD×0.105×df
체중 활동량(U/mg) = (U/ml)×1/C
| Vt | : 총 용량(4.1ml) |
| Vs | : 샘플 용량(0.1ml) |
| 39.0 | : 분석 조건에서 인다민 염료의 밀리몰 흡광 계수(cm2/마이크로몰) |
| t | : 반응 시간(10분) |
| df | : 희석 계수 |
| C | : 용해 시 효소 농도(c mg/ml) |
참조
1)W.Richmond; Clin.Chem., 19, 1350(1973).
2)HMFlegg; Ann.Clin.Biochem., 10, 79(1973).
3)CCAllain et al. ; Clin.Chem., 20, 470(1974).
4)PNTarbutton 및 CRGunter; Clin.Chem., 20, 724(1974).
5)S.Nomoto; Rinsho Kensa, 20, 688(1976).
6)Y.Kameno et al. ; Jap.J.Clin.Path., 24, 650 (1976).
표 1. 콜레스테롤 에스테라제의 기질 특이성
[반응은 37℃ 0.1M 아세테이트 완충액, pH 5.0, contg에서 10분 동안. 각 콜레스테롤 에스테르 0.2mM 및 Triton X-100 0.33%.]
콜레스테롤 에스테르 상대 활성(%) 리놀리에이트(18 :2) 100 아세테이트 (2 :0) 9 프로피오네이트(3 :0) 40 부티레이트(4 :0) 38 크로토네이트(4 :1) 0 < /tr>발레레이트(5 :0) 18 카프로에이트 (6 :0) 63 헵타노에이트(7 :0) 32 Caprylate(8 :0) 94 노나노에이트(9 :0) 120 < /tr>십실화(10 :0) 143 10 -Undecenoate(11 :1) 141
그림 1. 안정성(COE-301)(분말 형태)
(건조한 조건에서 보관)
< img src="/inday_fileinfo/img/v520240422194449." alt="그림 2. 안정성(COE-302)(분말형)">
그림 2. 안정성(COE-302)(분말 형태)
(건조한 조건에서 보관)
< img src="images/coe_301_302_img07.jpg" alt="그림 3. 안정성(분말 형태)">
그림 3. 안정성(분말 형태)
(건조한 조건에서 보관)
그림4. 안정성(40°의 액체 형태)
효소 농도: 20mg/ml 완충액 조성:0.2M boric acidborax contg. 0.1% sodium cholate and 0.6% Trinton X-100, pH5.5.
Fig.5.pH-Activity
37℃, 10 min-reaction in 0.1M buffer solution: pH3.0-6.0,acetate;pH6.0-8.0,phosphate; pH8.0-10.0,boric acid-KCI-sodium carbonate
Fig.6. Temperature activity
10min-reaction in 0.1M acetate buffer, pH5.5.
Fig.7. pH-Stability
25℃,20hr-treatment with 50mM buffer solution:pH2.0-4.0,citrate;pH4.0-6.0, acetate;pH6.0-8.0, phosphate;pH8.0-9.0,boric acid-KCI-sodium carbonate
Fig.8. Thermal stability
10min-treatment with 50mM acetate buffer,pH5.5 and 50mM phosphate buffer, pH7.0
활성 측정법(Japanese)
1. 원리
MBTH와 DMA의 산화축합 생성물인 Indamine 염료를 590nm에서 측정하고, 상기 반응에서 생성된 H2O2의 양(가수분해된 Cholesterol ester의 양)을 정량한다.
2. 정의
하기 조건 하에서 1분에 1 마이크로몰의 cholesterol ester를 가수분해하는 효소 활성을 1단위 ( U)로 한다.
3. 시약
- COD-POD 용액[Na2HPO4 O 14.4g, 붕산 31g, cholesterol oxidase (Grade III) 15,000 단위, POD 25,000 프리프로 갈린 단위 및 sodium cholate 290mg을 1,000ml의 증류수에 용해시켰다. 5로 조정합니다. (0~5℃ 보존으로 1개월 사용 가능)]
- DMA-MBTH 용액 [EDTA-Na2 400mg, DMA0.7ml 및 MBTH 150mg을 1,000ml 0.5M 아세트산 완충액, pH 4.7에 용해. (0 ~ 5 & # x2103; 차광 보존으로 1 주일 사용 가능)] 에서 가온 용해한다. 그것을 90ml의 1%(V/V) 트리톤 X-100과 혼화하고, 워터버스에서 교반하면서 70℃까지 가온한다. 또한,이 온도에서 15 분간 보온 한 후, 실온까지 유수 냉각한다. 이어서 상기 1% 트리톤 X-100으로 최종 액량을 100ml로 한다. (용시 제조)] pH 7.0에서 용해시키고 동일한 완충액으로 0.02-0.05U / ml로 희석한다.
4. 절차
1. 시험관에 다음 반응 혼합물을 제조하고 약 5 분 동안 예비 가온한다.
1.0ml COD-POD 용액 (A) 1.0ml DMA-MBTH 용액 (B) 0.1ml 효소 용액 2. 기질 용액(C) 1.0ml를 첨가하여 반응을 개시한다.
3. 정확히 37℃에서 10분간 반응시킨 후, 1.0N HCl(D) 1.0ml를 첨가하여 반응을 정지 하자. 이 용액 당 590 nm에서의 흡광도를 측정한다 (OD test).
4. 맹검은 반응 혼합물 1(단, 효소 용액 대신에 1.0ml의 기질 용액(C)을 첨가하여 조정)을 10 분간 방치 한 후, 1.0N HCl (D) 1.0ml를 첨가 한 후 효소 용액 0.1ml를 첨가하여 조정하고, 마찬가지로 흡광도를 측정한다 (OD blank).
5. 수식
U/ ml =
ΔOD/min (OD test-OD blank)×4.1(ml)×희석 배율
39.0×10(분)×0.1(ml)
< td>= ΔOD×0.105×희석 배율 U/mg =U/ml×1/C 39.0 : Indamine 염료의 상기 측정 조건 하에서 밀리몰 분자 흡광계수(㎠/micromole) C : 용해 시 효소 농도(c mg/ml)
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