장내 세균 유전자 검출 키트 - 프로브 검출 -은 식중독 원인균으로 알려진 살모넬라, 장관 출혈성 대장균 (EHEC), 이질균 유전자를 멀티플렉스 PCR로 증폭하고 프로브에 의해 검출하는 키트입니다. 검출 원리를 종래의 융해 곡선 해석으로부터 프로브 해석으로 변경함으로써, 판정을 괴롭히는 융해 곡선의 피크의 판단이 불필요해져, 판정이 용이하게 되었습니다. 또, 복수균종의 동시 검출이 가능하게 되었습니다.

● 프로브 해석을 채용하여 판정이 용이 경우가있었습니다. 본 제품에서는, 프로브법 해석을 도입한 것으로 특이성이 향상하고, 증폭 곡선에 의한 판정이 된 것으로, 판정이 용이하게 되었습니다.

【살모넬라 유전자 검출예】

● 복수균종의 동시 검출이 가능 융해 곡선 해석에서는, 반응액 중에 복수균종이 존재하고, 균수의 차이가 큰 경우, 균수가 많은 유전자만을 검출하는 것이 있었습니다만, 프로브 해석 하는 것으로, 동시 검출이 가능하게 되었습니다. 다른 균종이 10 ⁴ 카피와 10 카피로 1 튜브에 존재하더라도 프로브 분석은 10 ⁴ 카피뿐만 아니라 10 카피의 동시 검출이 가능합니다.
3균종의 동시 검출도 가능하므로, 다음 공정의 도말 배양에 이용하는 배지를 짜는 것이 가능합니다.

● 신속, PCR 반응 시간은 약 50분*
검변 현탁액을 가열·원심분리하는 것만으로 PCR에 사용할 수 있습니다. 실시간 PCR 장치에 반응액을 넣은 후 약 50분 안에 결과를 확인할 수 있습니다.
* 해석 시간은 실시간 PCR 장치의 종류에 따라 약간 다릅니다.

●간편 샘플의 조제는 검변 현탁액을 가열·원심 분리할 뿐입니다.
당사 독자 기술로 핵산 정제 불필요한 PCR을 실현했습니다. 검변 검체를 물에 현탁하고, 가열 처리와 원심분리를 실시한 것을 PCR에 사용합니다. 번거로운 DNA 정제는 필요하지 않습니다.
또, 본 제품은 멀티플렉스 PCR에 의해 3균종을 하나의 반응으로 검출할 수 있기 때문에, 리얼타임 PCR장치에 반응액을 세트하는 것만으로, 튜브를 열지 않고, 1튜브로 검출하는 것이 가능합니다.


●4채널의 동시 검출이 가능한 리얼타임 PCR장치에 대응 : Bio-Rad CFX96 Touch ^TM Deep Well 실시간 PCR 장치, Roche LightCycler ^® 96 등).

●캐리오버 오염의 리스크를 저감 위양성의 발생 원인으로서, 캐리오버 오염이 있습니다. 본 제품은 PCR에서 형광 검출까지 튜브를 열지 않고 1튜브로 검출할 수 있기 때문에 캐리오버의 위험이 감소하고 있습니다. 또한 본 제품은 혼입된 증폭 산물을 분해할 수 있는 Uracil-DNA Glycosylase를 PCR Master Mix에 포함하기 때문에 10 ³ ~ 10 ⁴ 카피/반응 정도의 혼입된 PCR 증폭 산물을 분해하여 위양성을 예방할 수 있습니다.

●검변 검체의 스크리닝에 이용 가능 본 제품은, 50 검체를 풀한 대변 검체로부터 장내 세균의 검출이 가능한 감도를 가지고 있습니다. 따라서 검변 검사를 선별하는 데 사용할 수 있습니다. 본 제품에 의한 스크리닝을 실시하는 이점으로서 다음의 4점을 들 수 있습니다.

1) 검사 당일에 90~95%의 음성 검체를 판정할 수 있습니다.
스크리닝은 몇 시간 안에 완료할 수 있으므로 검사 당일에 90~95%의 음성을 판정할 수 있습니다. 양성이 된 풀에 포함되는 검체는, 개별적으로 배양법으로 검사하여 양성을 판정합니다.

2) 도말 배양의 검체수를 10분의 1 이하로 저감할 수 있습니다.
본 제품으로 90~95% 정도의 음성 검체를 배제할 수 있으므로, 배양법의 검체수를 전체 검체수의 10분의 1 이하로 저감할 수 있습니다.

3) 여러 균종의 동시 검출이 가능하기 때문에 도말 배지를 선택할 수 있습니다.
융해 곡선 분석 타입의 검사 키트에서는 양성 풀에 대해, 모든 균종에 대응하는 배지에 도말 배양할 필요가 있었습니다. 본 제품에서는 균종의 식별도 명확하고, 공감염의 동시 검출이 가능하게 되었기 때문에, PCR 양성균종에 대응하는 배지에만 도말 배양하는 것이 가능하고, 도말 매수의 삭감이 가능합니다.

4) 판정이 간편합니다.
본 제품에서는 증폭 곡선으로 판정을 실시합니다. 그 때문에, 콜로니의 색이나 형상에 의한 판정에 비해 판정이 간편합니다. 검출 원리를 종래의 융해 곡선 해석으로부터 프로브 해석으로 변경함으로써, 판정을 괴롭히는 융해 곡선의 피크의 판단이 불필요해져, 판정이 용이하게 되었습니다.

검출 감도 확인

살모넬라 게놈 DNA, 장관 출혈성 대장균 게놈 DNA, 이질균 게놈 DNA를 각각 1,000 카피, 100 카피, 10 카피/반응이 되도록 음성 대변의 열처리액에 첨가한 것을 샘플로서 본 제품을 사용하여 검출 했습니다. 분석에는 Bio-Rad CFX96 Touch ^TM Deep Well 실시간 분석 시스템을 사용했습니다.



그 결과, 어느 유전자의 증폭을 확인할 수 있었다. 또, 음성 대변을 샘플로서 본 제품을 이용하여 검출을 실시한 결과, 내부 표준만의 증폭이 인정되어, 음성이라고 판정되었습니다.